[发明专利]特异性更强的禽坦布苏病毒检测试剂盒

说明书

本发明提供一种特异性更强的禽坦布苏病毒检测试剂盒。所述检测试剂盒包含特异性检测禽坦布苏病毒的引物ATMUV‑F、ATMUV‑R和探针ATMU‑probe。该检测试剂盒灵敏度高、稳定性好、特异性强、重复性好，可用于禽坦布苏病毒特异性检测，为后续科学研究禽坦布苏病毒致病机理和开展分子流行病学奠定基础。

技术领域

本发明属于动物病毒学领域，具体涉及一种特异性更强的禽坦布苏病毒检测试剂盒。

背景技术

实时荧光定量PCR方法（Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。实时荧光定量PCR在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系。目前根据所使用荧光化学物质的不同，主要包括荧光染料和荧光探针两类。荧光探针是基于荧光共振能量转移(fluorescence resonanceenergy transfer, FRET)原理。TaqMan 探针是水解探针的代表，对目标序列有很高的特异性，同时结合引物的特异性，使得qRT-PCR技术的特异性和准确性极大提高，而且反应结束后不需进行寡核苷酸熔解曲线分析，缩短了实验时间，可避免SYBR GreenⅠ实时荧光定量方法可能导致的结果误读误判。MGB TaqMan 探针是经过改进的探针，其3'端采用的是非荧光性的淬灭基团，大大降低了本底信号的干扰；尤其是该探针的3'端还连接了1 个MGB，使探针与模板的杂交更加稳定，提高探针熔解温度(melting temperature, Tm)，使较短的探针也能达到较高的Tm 值；又由于短探针的荧光基团和淬灭基团的距离较近，所以淬灭效果更好，荧光背景更低；另外短探针也节约了探针设计成本，可同时对单一样本（尤其针对样品难以获取或病原载量较低样本）开展多种病原学检测，具有高通量、成本低廉、结果迅速等优点，在新发传染病等领域被广泛使用。

禽坦布苏病毒（avian tembusu virus，ATMUV）感染是一种以高热、采食量骤降、产蛋率急剧下降、卵泡出血为特征的传染病。该病于2010年4月最初出现在我国东部地区（浙江、福建、山东等）种（蛋）鸭群，引起患病种（蛋）鸭群从高产蛋率（80%-95%）下降至20%-30%，甚至有的停产，剖检可见病鸭卵泡充血、出血。随后，蛋鸡群也出现坦布苏病毒感染，引起蛋鸡发热、采食减少或食欲废绝、产蛋急降或停止，剖检可见卵泡出血，部分卵黄破裂；鹅感染坦布苏病毒后表现产蛋急剧下降、神经症状（如摇头），剖检主要见卵巢出血或卵黄液化。此外，肉鸭、肉鸡、鸽、麻雀感染该病的报道。目前，鸭坦布苏病毒感染波及我国大部分家禽养殖区，给我国养禽业造成了巨大的经济损失。。

本发明建立的禽坦布苏病毒MGB TaqMan 探针实时荧光定量PCR方法不仅可用于流行病学检测且可对禽坦布苏病毒感染程度进行精确定量（比SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法敏感性更高），可有效用于禽坦布苏病毒致病机制差异研究，本发明可填补国内外相关研究领域空白。

发明内容

本发明的目的在于，针对现有技术的不足，提供一种特异性更强的禽坦布苏病毒检测试剂盒。本发明的检测试剂盒特异性强，灵敏度高，重复性好，能用于快速、准确的检测禽坦布苏病。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种检测禽坦布苏病毒的引物和探针，所述引物和探针的核苷酸序列如下：

引物ATMUV-F：5’- GGTCCTCCCCATGATTCTGA -3’；

引物ATMUV-R：5’-AGATACCGTATTGGAAGTCCTTTCA -3’；

探针ATMUV-probe：5’- FAM-CTCCGACTCGGGTGGT-MGB-3’。

上述一种检测禽坦布苏病毒的引物和探针在检测禽坦布苏病毒中的应用。