[发明专利]二价环状DNA链的制备方法、二价环状核酸适体及其应用

说明书

本发明公开了一种二价环状DNA链的制备方法、二价环状核酸适体及其应用。该方法通过在两条DNA单链的两端分别修饰基团，然后通过化学反应可以快速的将两条DNA单链连接起来，反应过程无需模板链，只需在DPBS缓冲液和室温下就可进行。并且不需要粘性末端进行碱基互补配对，所以对于短链DNA也是适用的，适用范围更广。此方法很好的克服了通过DNA连接酶的方法构建二价环形结构的不足。

技术领域

本发明涉及核酸适体及其制备技术领域，特别是涉及一种二价环状DNA链的制备方法、二价环状核酸适体及其应用。

背景技术

核酸适体是通过体外过程SELEX(通过指数富集的配体系统进化)产生的核酸探针，它可以折叠成不同的三级结构来特异性识别一组靶标。因此，适体作为分子探针在癌症的诊断和治疗中受到了广泛的关注。但是天然的核酸容易受到生物介质，尤其是血清的影响很快被降解，这限制了核酸适体在体内的应用。为了提高适体在生物介质中的稳定性，采取了一系列的方法，比如对适体进行化学修饰，选择后修饰和SELEX筛选修饰的寡核苷酸文库是化学修饰产生耐核酸酶适体的传统方法，但是这种修饰会影响适体的特异性和亲和力。

此外，还可通过T4连接酶将两条适体连接起来形成环状适体，以此来增加适体的抗酶切能力，但是这种方法只能连接含有粘性末端的发卡结构，并且不适用短链的发卡结构。如专利CN110354268A-一种核酸适体及其环形二价核酸适体-药物的偶联系统与应用中所提到的利用DNA连接酶的方法构建。该方法需要使用具有特定分子结构的发卡型核酸适体，此外需要具有碱基互补配对的颈环，因为在一定的碱基互补配对作用下，才可以提供足够的力将发夹固定在一起，除此之外还要再末端延伸出一段序列跟另一条核酸适体延伸出的序列形成碱基互补配对。在DNA链满足结构的要求后，加入DNA连接酶的缓冲液，在酶的作用下将两条链连接在一起形成二价环形结构。这种方法具有一定的局限性，它只能用于具有发卡结构的核酸适体的二价环形结构的构建，并且需要延伸出一段粘性末端，而且由于结构特殊性，对于较短的DNA单链不能通过此方法构建二价环形结构。

发明内容

基于以上技术的缺点，本发明的首要目的在于提供一种化学连接方法来形成二价环状DNA链的制备方法，以解决现有技术存在的问题。

二价环状DNA链的制备方法：两条DNA单链的两端分别修饰基团，然后通过化学反应将两条DNA单链连接起来形成二价环状DNA链；两条DNA单链的序列相同或者不同；每条DNA单链的3’和5’端修饰的基团相同，且能够与另一条DNA单链修饰的基团至少发生下述的任一反应：

叠氮基团和二苯基环辛炔基团的点击化学反应；

叠氮基团和环辛炔基基团的点击化学反应；

叠氮基团和炔基基团的点击化学反应；

马来酰亚胺基基团和呋喃基团的加成反应；

NHS酯基基团和氨基基团的取代反应；

硫代磷酸基团和氯乙酰基基团的SN₂反应；

氨基基团和羧基基团的缩合反应。

具体包括：

(1)一条3’和5’端均修饰叠氮基团(-N₃)的DNA单链，与另一条3’和5’端均修饰二苯基环辛炔基团(-DBCO)的DNA单链发生点击化学反应；

(2)一条3’和5’端均修饰叠氮基团的DNA单链，与另一条3’和5’端均修饰环辛炔基基团的DNA单链发生点击化学反应；

(3)一条3’和5’端均修饰叠氮基团的DNA单链，与另一条3’和5’端均修饰炔基基团的DNA单链发生点击化学反应；

(4)一条3’和5’端均修饰马来酰亚胺基基团的DNA单链，与另一条3’和5’端均修饰呋喃基团的DNA单链发生加成反应；