[发明专利]一种胃癌前状态类器官模型的建立方法及专用培养基

权利要求书

1.胃癌前状态类器官模型的建立方法，包括使用用于构建胃癌前状态类器官模型的培养基对胃黏膜腺体进行培养的步骤；

所述用于构建胃癌前状态类器官模型的培养基，包括胃类器官完全培养基和1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍；

所述1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍在所述用于构建胃癌前状态类器官模型的培养基中的浓度为25~200 μM；

以质量浓度计，所述胃类器官完全培养基由下述组分组成：

50 ng/ml 表皮生长因子；

100 ng/ml 人头蛋白；

500 ng/ml R-脊椎蛋白；

10 nM 胃泌素；

1 μM N-乙酰基-L-半胱氨酸；

100 ng/ml重组人成纤维细胞生长因子-10；

100 ng/ml 无翅型MMTV整合位点家族成员3A；

10 μM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸；

50 μg/ml L-谷氨酰胺；

100 μg/ml青链霉素混合溶液；

体积为Advanced DMEM/F12基础培养基100倍的N2 添加剂；

体积为Advanced DMEM/F12基础培养基50倍的B27添加剂；

及余量的Advanced DMEM/F12基础培养基；

所述用于构建胃癌前状态类器官模型的培养基还包括用于溶解所述1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍的有机溶剂；所述有机溶剂为二甲基亚砜；

所述培养的条件为下述C1或C2：

C1：于37℃、5％CO₂浓度下培养5~10天；

C2：于37℃、5％CO₂浓度下培养5天后将胃类器官解离、重悬为单细胞后加入所述培养基于37℃、5％CO₂浓度下继续培养3天。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法还包括取全胃，分离获得所述胃黏膜腺体的步骤。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述分离的步骤如下：将所述全胃消化孵育后置于摇动缓冲液中进行摇动，离心，收集细胞团沉淀，得到所述胃黏膜腺体。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述消化孵育的条件如下：于4℃下在5 mM的EDTA溶液中孵育1~2h；

所述摇动步骤中，每20 μL悬浮液中需达到50~100个长条状完整胃黏膜腺体；

所述摇动缓冲液由200 ml：2 g：3 g的磷酸盐缓冲液、山梨糖醇和蔗糖组成；

所述离心的条件如下：于4℃、300 g下离心5 min。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述对胃黏膜腺体进行培养的步骤如下：将所述胃黏膜腺体于37℃下在基质胶中固化15 min后加入所述用于构建胃癌前状态类器官模型的培养基进行培养。