[发明专利]一种体细胞核移植方法及其应用

说明书

本发明涉及一种体细胞核移植方法及其应用。该方法利用单倍体胚胎干细胞体系获得单等位基因同时敲除26个H3K27me3相关的印记基因中的一个或多个的供体体细胞进行核移植。结果显示，单等位敲除Slc38a2、Slc38a4、Sfmbt2、Etv6、Platr4、Gramd1b、Slc38a1、Gab1、Mbnl2、Smoc1、Bmp7、Rbms1、Fam198b、Sh3gl3、Hunk、Jade1、E2f3、Tle3、Runx1、Epas1、Bbx、Enc1、Inhbb、Sox21、Otx2、Rbp2中的一个或多个(如Sfmbt2、Jade1、Gab1和Smoc1这四个中的一个或多个)H3K27me3的印记基因使得这些基因的印记表达模式趋于正常。同时，利用该供体体细胞进行克隆可以将体细胞克隆效率提升至14％，而野生型的对照组体细胞克隆效率为0。另外，该方法获得的克隆动物，大胎盘‑大胎儿现象得到了修正。

技术领域

本发明涉及动物生物技术领域，具体地，本发明涉及一种体细胞核移植方法及其应用。

背景技术

体细胞核移植技术(SCNT)可将体细胞核重编程使其达到全能性状态，其在动物育种和再生医学领域中具有巨大的应用潜力(Rideout et al.，2001)。然而，核移植胚胎极低的发育效率和经常观察到的发育异常表明体细胞重编程存在表观遗传障碍(Lu andZhang,2015)。在这些异常中，大胎综合征(LOS)是最常见的一种，在克隆牛、羊和老鼠中均有发现。该综合症指的是一组异质性的症状，包括出生时体型过大和严重的出生缺陷(Yanget al.，2007)。在鉴定和克服核移植过程中关键的表观遗传障碍方面研究已经取得了进展，包括抑制组蛋白去乙酰化、减少DNA甲基化和去除体细胞异质性的H3K9me3等(Dai etal，2010；Gao et al；2018；Kishigami et al，2006；Matoba et al.，2014)，这些方法均能显著提高核移植胚胎的发育效率，但对所有克隆哺乳动物的缺陷影响作用不大。尽管在克隆动物中也观察到印记异常，但DNA甲基化介导的典型基因组印记相对稳定，超出当前卵母细胞质的重编程的能力(Humpherys et al.，2014)。例如，利用原始生殖细胞进行克隆不能恢复缺陷印记状态或产生可存活的幼崽(Inoue et al.，2002；Kamimura，2014；Lee，2002；Tucci，2019)。基于以上原因，基因组印记通常不被认为是核移植重编程的表观遗传障碍(Fulka et al.，2004；Kamimura，2014)。目前进行克隆的供体细胞均为体细胞，而最新研究发现小鼠胚外组织的胚胎的印记模式与胎体来源的不同，这印证着以目前常规的供体细胞进行克隆其外组织发育是存在异常的。

因此，体细胞核移植方法还需进一步研究。

发明内容

本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：

通过体细胞核移植的方式进行成功的克隆需要克服明显存在的表观遗传障碍。尽管在胚胎期E6.5天的胚胎上胚层和胚外组织中H3K27me3依赖的印记基因会呈现出差异性表达，但基因组印记通常不被认为是核移植失败的一个障碍。基于上述问题，发明人通过大量的实验探索，获得了一种显著提升核移植效率的方法，该方法利用单倍体胚胎干细胞体系获得单等位基因敲除26个H3K27me3相关的印记基因中的一个或多个的供体体细胞进行核移植。结果显示，单等位敲除Slc38a2、Slc38a4、Sfmbt2、Etv6、Platr4、Gramd1b、Slc38a1、Gab1、Mbnl2、Smoc1、Bmp7、Rbms1、Fam198b、Sh3gl3、Hunk、Jade1、E2f3、Tle3、Runx1、Epas1、Bbx、Enc1、Inhbb、Sox21、Otx2、Rbp2中的一个或多个(如Sfmbt2、Jade1、Gab1和Smoc1这四个中的一个或多个)H3K27me3的印记基因使得这些基因的印记表达模式趋于正常。同时，利用该供体体细胞进行克隆可以将体细胞克隆效率提升至14％，而野生型的对照组体细胞克隆效率为0。另外，该方法获得的克隆动物，大胎盘-大胎儿现象得到了修正。