[发明专利]一种稳定产生牛病毒性腹泻病毒抗原的细胞系及抗体胶体金检测试纸条的制备方法

说明书

本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种稳定产生牛病毒性腹泻病毒抗原的细胞系及抗体胶体金检测试纸条的制备方法。该细胞系按照以下方法制备：将牛病毒性腹泻病毒接种于敏感细胞系，通过有限稀释法筛选持续性感染细胞，进行克隆纯化和病毒滴度测定，确定滴度高于10⁷_.⁰TCID₅₀的细胞建系。本发明制备了可以持续稳定产生牛病毒性腹泻病毒抗原的细胞系，应用该细胞系不需要再接种毒种，按照正常细胞传代，既可节约毒种用量，又避免操作复杂易造成污染等问题，节省人力物力。本发明的牛病毒性腹泻病毒抗体胶体金检测试纸条具有特异性强、灵敏度高、简单快速、操作简单快捷等特点，易于推广，适用于基层养殖场检测，具有广阔的市场前景。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种稳定产生牛病毒性腹泻病毒抗原的细胞系及抗体胶体金检测试纸条的制备方法。

背景技术

牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV)，亦称为牛病毒性腹泻/黏膜病毒，是黄病毒科瘟病毒属重要成员，与猪瘟病毒、羊的边界病毒同科同属，在血清学检测时存在交叉反应。BVDV是在世界范围内广泛流行严重危害养殖业的重要病原，病毒可感染牛、羊、猪等多种动物。BVDV的感染造成养殖业巨大的经济损失，在美国，每100万犊牛中，由BVDV感染造成的损失可达2000至5700万美元不等。在我国，李佑民等于1983年首次分离并鉴定出BVDV。自此以来，我国新疆、内蒙、吉林、黑龙江、河南、山东、辽宁等20多个省、市、自治区均检出此病，个别地区阳性率在85％以上。由于没有很好的免疫防护措施，本病呈上升趋势，对牛群的肥育、产奶和繁殖影响极大，给养牛业造成了严重危害。BVDV的感染可引发多种临床疾病，包括呼吸系统疾病、生殖系统疾病、以及免疫抑制。还可以为其他致病原侵染动物创造条件引起继发感染，这样对牛群的危害也是不容忽视的。

BVDV依据接种细胞是否产生致细胞病变(cytopathogenic effects,CPE),将BVDV分为两种生物型，致细胞病变型(cytopathic,cp)与非致细胞病变型(non-cytopathic,ncp)。临床上分离毒株多为非致细胞病变型。ncpBVDV经常随污染牛血清而感染细胞，造成细胞的持续性牛病毒性腹泻病毒感染。

牛血清是生物制品研发及医学研究的重要原材料，牛血清中含有牛病毒性腹泻病毒抗体会影响同科属其他病毒疫苗生产，如猪瘟病毒。含有牛病毒性腹泻病毒抗体的血清严重降低猪瘟疫苗的效价。因此采集血清时需要逐头牛进行检查。目前，常规的血清中和实验方法检测步骤繁琐、耗时，需要专业人员进行操作且主要依赖实验室。用于该病毒抗体检测的商品化试剂盒主要是进口的试剂盒，价格昂贵而且需要专业人员操作和精明仪器(酶标仪)不能满足基层实际需求，严重阻碍了牛病毒性腹泻病检测的普及和推广。因此，研究一种简单、快捷的牛病毒性腹泻病毒抗体检测方法具有十分重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种稳定产生牛病毒性腹泻病毒抗原的细胞系及抗体胶体金检测试纸条的制备方法。应用该细胞系不需要再接种毒种，按照正常细胞传代，既可节约毒种用量，又避免操作复杂易造成污染等问题，节省人力物力。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种持续稳定产生牛病毒性腹泻病毒抗原的细胞系，该细胞系按照以下方法制备：将牛病毒性腹泻病毒接种于敏感细胞系，通过有限稀释法筛选持续性感染细胞，进行克隆纯化和病毒滴度测定，确定滴度高于10^7.0TCID₅₀的细胞建系，得到持续稳定产生牛病毒性腹泻病毒抗原的细胞系；

敏感细胞系为MDBK细胞系、BT细胞系、PT细胞系、ST细胞系、PK细胞系、CRFK细胞系、F81细胞系、MDCK细胞系中的一种。

作为优选，克隆纯化的次数为3次或3次以上。

在本发明提供的具体实施例中，克隆纯化的次数为3次。