[发明专利]一种石斑鱼神经坏死病高抗体水平亲本选育方法

说明书

本发明涉及一种石斑鱼神经坏死病高抗体水平亲本选育方法，属于石斑鱼抗病育种技术领域，通过构建重组NNV衣壳蛋白‑靶标‑HRP酶标兔抗石斑鱼二抗间接法检测系统，利用底物显色检测吸光值变化来分析样品中抗NNV病毒抗体水平。抗体水平决定了抗病能力的强弱，选择天然抗体水平高的石斑鱼作为抗病品种选育的亲本。本发明方法能够快速简单的选择出抗病个体，简化抗病品种选育过程，节省选育成本。

技术领域：

本发明属于石斑鱼抗病育种技术领域，具体涉及一种石斑鱼神经坏死病高抗体水平亲本选育方法。

背景技术：

石斑鱼是我国沿海名贵鱼类，随着石斑鱼苗种培育技术的突破，养殖业迅速发展、养殖规模不断扩大，养殖过程中病害问题日趋凸显，尤其是近两年来，育苗过程中常因感染神经坏死病毒(NNV)导致患病毒性神经坏死病，对仔鱼和幼鱼危害很大，严重者在一周内死亡率可达100％，对成鱼进行持续性感染，在一些情况下可不显示临床症状，并通过性腺进行病毒的垂直传播，加大了该病的控制难度。

实现石斑鱼的抗神经坏死病育种是产业亟需解决的问题，目前产业上没有很好的对策，石斑鱼抗病选育对解决这一技术问题具有更重要的意义。

发明内容：

本发明要解决的技术问题在于提供一种石斑鱼神经坏死病高抗体水平亲本选育方法，所述方法通过ELISA方法检测石斑鱼体内的天然抗体水平，抗体水平决定了抗病能力的强弱，选择天然抗体水平高的石斑鱼作为抗病品种选育的亲本。

本发明方法通过构建重组NNV衣壳蛋白-靶标-HRP酶标兔抗石斑鱼二抗间接法检测系统，利用底物显色检测吸光值变化来分析样品中抗NNV病毒抗体水平。其原理是：将重组的NNV衣壳蛋白包被在96孔板上，然后加入待测石斑鱼血清，用固定的重组衣壳蛋白去捕捉样品中的抗NNV抗体，再运用HRP标记的兔抗石斑鱼二抗去结合石斑鱼抗NNV抗体。用辣根过氧化物酶显色试剂盒显色，根据吸光值变化分析抗NNV病毒抗体水平。

本发明的具体技术方案如下：

一种石斑鱼神经坏死病高抗体水平亲本选育方法，所述方法包括重组NNV衣壳蛋白，建立基于重组NNV衣壳蛋白和HRP标记兔抗石斑鱼二抗检测的间接法ELISA方法，利用所述方法在天然石斑鱼无症状养殖群体中进行抗体检测，选择抗体水平高的石斑鱼组成抗病品种选育亲本；

所述的重组NNV衣壳蛋白的方法为：NNV衣壳蛋白序列与GenBank Accession：ATJ33902中的序列一致，表达载体为pGEX-6P-1，感受态细胞为大肠杆菌BL21(DE3)，诱导条件为在37℃、250rpm条件下，当OD达到0.6时加入IPTG，直至IPTG终浓度为0.5mM，降温至25℃，诱导表达6h；重组表达的GST融合蛋白序列为：MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDLEVLFQGPLGSPMVRKGEKKLAKPATTKAANPQPRRRANNRRRSNRTDAPVSKASTVTGFGRGTNDVHLAGMSRISQAVLPAGTGTDGYVVVDATIVPDLLPRLGHAARIFQRYAVETLEFEIQPMCPANTGGGYVAGFLPDPTDNDHTFDALQATRGAVVAKWWESRTVRPQYTRTLLWTSSGKEQRLTSPGRLILLCVGNNTDVVNVSVLCRWSVRLSVPSLETPEETTAPIMTQGSLYNDSLSTNDFKSILLGSTPLDIAPDGAVFQLDRPLSIDYSLGTGDVDRAVYWHLKKFAGNAGTPAGWFRWGIWDNFNKTFTDGVAYYSDEQPRQILLPVGTVCTRVDSEN