[发明专利]一种石斑鱼神经坏死病高抗体水平亲本选育方法

权利要求书

1.一种石斑鱼神经坏死病高抗体水平亲本选育方法，其特征在于所述方法包括重组NNV衣壳蛋白，建立基于重组NNV衣壳蛋白和HRP标记兔抗石斑鱼二抗检测的间接法ELISA方法，利用所述方法在天然石斑鱼无症状养殖群体中进行抗体检测，选择抗体水平高的石斑鱼组成抗病品种选育亲本；

所述的重组NNV衣壳蛋白的方法为：NNV衣壳蛋白序列与GenBank Accession：ATJ33902中的序列一致，表达载体为pGEX-6P-1，感受态细胞为大肠杆菌BL21(DE3)，诱导条件为在37℃、250rpm条件下，当OD达到0.6时加入IPTG，直至IPTG终浓度为0.5mM，降温至25℃，诱导表达6h；重组表达的GST融合蛋白序列为如SEQ ID NO.1所示；

所述间接ELISA方法的具体步骤如下：

(1)包埋：用包埋液将重组蛋白包埋至96孔板中，并清洗；

(2)封闭：加入封闭液进行封闭，并清洗；

(3)抗NNV抗体的捕获：将石斑鱼样品加入孔板中，孵育结合，使重组蛋白充分捕捉待测样品中的抗NNV抗体，清洗；

(4)检测：再向孔板中加入带有辣根过氧化物酶标记的兔抗石斑鱼二抗，清洗；

(5)TMB显色试剂盒显色：每孔加入TMB底物显色液，室温避光反应，加入终止液终止反应，比色观察，并用酶标仪测定450nm吸光度值，根据吸光度值分析抗NNV抗体水平。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的清洗，均采用TBST进行清洗。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤(1)中加入0.1μg石斑鱼神经坏死病毒重组的衣壳蛋白，4℃包埋过夜。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤(2)中加入的封闭液为质量分数为5％的脱脂奶粉。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤(3)中的石斑鱼样品为血清样品，稀释倍数400倍，37℃培养箱孵育1小时。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的步骤(4)中加入二抗浓度为1.6μg/ml100微升，37℃培养箱孵育45分钟。