[发明专利]一种牛结节性皮肤病病毒可视化快速核酸检测方法

权利要求书

1.一种牛结节性皮肤病病毒可视化快速核酸非诊断目的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)针对牛结节性皮肤病病毒的LSDV orf068基因设计重组酶聚合酶扩增引物；

(2)提取样品总DNA，利用步骤(1)中的引物进行重组酶聚合酶扩增；

(3)向步骤(2)的扩增产物中加入Cas12a蛋白并进行酶切反应，所述酶切反应体系包括：

用于切割单链DNA的Cas12a蛋白；

引导Cas12a蛋白特异性结合于靶标核酸分子的sgRNA；

含有可检测的标记物和淬灭剂的核酸探针；

(4)对核酸探针发出的信号进行检测，

所述LSDV orf068基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示；

所述重组酶聚合酶扩增引物的序列如下：

orf068-RPA-F：5’-ATGGGTAAAAGATTTCTATATTCCTCACGGAAA-3’

orf068-RPA-R：5’-CTTTGTGATGCATCTAAGCTTTATAGGATT-3’；

所述sgRNA的核苷酸序列为：

5’-TCATTTCTGCAGAATATTTAGGCGATCTACAACAGTAGAAAT-3’。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述重组酶聚合酶扩增的反应体系为：

3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述Cas12a蛋白酶切体系为：

4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述信号检测方法为：

利用手机对反应后的体系在紫外或蓝光下拍照，或

利用凝胶成像系统拍照，或

利用多功能酶标仪测量荧光值。

5.一种牛结节性皮肤病病毒的可视化快速核酸检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：

(1)用于对牛结节性皮肤病病毒的LSDV orf068基因进行重组酶聚合酶扩增的引物，所述LSDV orf068基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示；所述重组酶聚合酶扩增引物的序列如下：

orf068-RPA-F：5’-ATGGGTAAAAGATTTCTATATTCCTCACGGAAA-3’

orf068-RPA-R：5’-CTTTGTGATGCATCTAAGCTTTATAGGATT-3’；

(2)用于对扩增产物进行可视化快速核酸检测的反应体系，该体系包括，

用于切割单链DNA的Cas12a蛋白；

引导Cas12a蛋白特异性结合于靶标核酸分子的sgRNA；所述sgRNA的核苷酸序列为：5’-TCATTTCTGCAGAATATTTAGGCGATCTACAACAGTAGAAAT-3’；

含有可检测的标记物和淬灭剂的核酸探针。

6.权利要求5所述的试剂盒在牛结节性皮肤病病毒可视化快速核酸非诊断目的检测中的应用。