[发明专利]一种混菌耦合发酵规模化合成6’-唾液酸乳糖的方法

说明书

本发明公开了一种混菌耦合发酵规模化合成6'‑唾液酸乳糖的方法，属于生物发酵领域。本发明通过在微生物异源表达了α‑2,6‑唾液酸转移酶和CMP‑唾液酸合成酶，构建得到了重组菌，将两株重组菌及酵母菌加入含有CMP、唾液酸和乳糖的反应体系中，能够直接价合成6'‑唾液酸乳糖。6'‑唾液酸乳糖转化率为82％，产量达到42g/L。该生产工艺显著降低了生产成本，能够应用于工业化的大规模生产。

技术领域

本发明涉及一种混菌耦合发酵规模化合成6′-唾液酸乳糖的方法，属于生物发酵领域。

背景技术

母乳寡糖(human milk oligosaccharides，HMOs)广泛存在于母乳中，是一类重要的低聚糖，它由3-14 个单糖所组成的，其基本单体有以下五种：D-葡萄糖(Glc)、D-半乳糖(Gal)、L-岩藻糖(Fuc)、N- 乙酰葡糖胺(N-acetylglucosamine，GlcNAc)和唾液酸(N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid，Neu5Ac)，他们以不同种方式连接形成多种低聚糖。母乳中的HMOs主要可以分为三大类：岩藻糖基化的HMOs、非岩藻糖基化的HMOs和唾液酸化的HMOs，其中岩藻糖基化和非岩藻糖基化的HMOs都属于中性寡糖，而唾液酸化的HMOs属于酸性寡糖^[16]。

HMOs作为母乳中仅次于脂类和乳糖的第三大成分，对婴幼儿的健康成长发育起着重要作用。HMOs 在人体中不会被消化吸收，而是直接到达肠道中，促进肠道的有益菌群的生长繁殖，抑制有害菌群的生长，从而起到调控肠道菌群和抗致病菌肠道粘附的作用。同时，HMOs还可以调控免疫系统，它通过调控肠道中细胞的基因表达，来调节淋巴细胞产生淋巴因子的水平，还能刺激机体产生免疫活性物质，从而提高机体对细菌的免疫力。并且，HMOs及其代谢产物，例如唾液酸，在促进婴幼儿大脑发育方面起着重要作用。

唾液酸化的HMOs包括两种，是乳糖通过α-2,3或α-2,6在唾液酸化的末端形成3′-唾液酸乳糖 (3′-sialyllactose，3′-SL)或6′-唾液酸乳糖(6′-sialyllactose，6′-SL)，结构如图1所示。唾液酸化乳糖具有抗菌活性，可以抗菌、抗感染，提高机体免疫力，促进婴幼儿大脑发育、增强人体记忆力，改善肠道菌群等作用。

唾液酸化乳糖的合成方法主要有两种：一种是化学合成法，涉及到保护和去保护等步骤，步骤复杂，分离纯化困难，且成本较高，不适合规模化生产。另一种合成方法为生物合成法。但是目前报道的主要是 3′-SL的生产，关于6′-SL的生物法合成鲜有报道。

目前高档奶粉中已经实现了6′-SL的添加，但主要从牛奶中提取，价格相对高昂。如何实现6′-SL的生物合成是降低其价格，实现人人可以享用目的的关键所在。

发明内容

本发明以酿酒酵母将CMP转化为CTP为起始出发点，以最终实现6′-SL的合成为目标。首先由于酵母细胞自身拥有的相关酶系，酿酒酵母有来源广泛、成本低、培养周期短等优点，且不能利用乳糖，所以利用酿酒酵母将CMP转化为CTP，来实现CTP源源不断的合成，通过探索最佳转化时间以及酵母重复利用率，得到高转化率的CTP，再以CTP、Neu5Ac为底物，在工程菌株JM109(DE3)-pET28a-neuA的催化下全细胞合成CMP-Neu5Ac，再以CMP-Neu5Ac和乳糖为底物，在工程菌株JM109-(DE3)-pET28a-ST6的催化下全细胞合成6′-SL，最终实现将三菌株耦合发酵生产6′-SL，并探究不同底物浓度对合成6′-SL的影响，以选择最适合6′-SL规模化生产且经济的反应体系。

本发明提供了一种生产6′-唾液酸乳糖的方法，所述方法是以CMP、唾液酸和乳糖为底物，通过酿酒酵母、表达α-2,6-唾液酸转移酶的重组菌和表达CMP-Neu5Ac合成酶的重组菌三株菌株混菌进行发酵；

或，以CMP和唾液酸为底物时，先加入酿酒酵母菌和表达CMP-Neu5Ac合成酶的重组菌合成 CMP-Neu5Ac，再加入乳糖和表达α-2,6-唾液酸转移酶的重组菌；