[发明专利]高效表达利什曼原虫PEPCK的人复制缺陷型重组腺病毒载体

说明书

本发明属于生物技术领域，针对目前利什曼病的现状公开了一种高效表达利什曼原虫磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶(PEPCK)的人复制缺陷型重组腺病毒载体。具体为将修饰后的PEPCK基因与pShuttle‑CMV载体构建的重组载体pShuttle‑CMV‑Leish‑PEPCK和pAdEasy‑1载体进行同源重组，得到的质粒载体pAd5‑L.m‑PEPCK经过PacI切割，转染进人胚肾细胞293而获得复制缺陷型重组腺病毒载体Ad5‑L.m‑PEPCK。经考马斯亮蓝R250染色和特异抗体抗His标签抗体的Western blot分析表明重组腺病毒载体Ad5‑L.m‑PEPCK能够高效表达PEPCK蛋白。由于利什曼原虫磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶(PEPCK)是最近发现的最有免疫优势的利什曼病抗原。因此本发明重组腺病毒载体Ad5‑L.m‑PEPCK可用于利什曼病的疫苗，从而有助于利什曼病的防控。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体为一种高效表达利什曼原虫PEPCK的人复制缺陷型重组腺病毒载体。

背景技术

利什曼病(leishmaniasis)，又称黑热病。它的病原体是几种趋内脏的利什曼原虫。原虫主要寄生于病人体内的巨噬细胞里，由双翅目昆虫白蛉为传播媒介。临床特征主要表现为长期不规则的发热、脾脏肿大、贫血、消瘦、白细胞减少和血清球蛋白的增加。如不予合适的治疗，患者大都在得病后1-2年内因并发其它疾病而死亡。

世界卫生组织把黑热病列为再度回升的一种寄生虫病。黑热病的分布极广，波及亚、欧、非及拉美四大洲。全球超过88个国家有黑热病流行，约有3.5亿人口生活在疫区，每年有新感染病例10万左右，各地黑热病的流行病学特征不尽相同。中国一直受到黑热病的困扰，黑热病在我国长江以北的16个省、直辖市、自治区曾广泛流行，包括辽宁、河北、北京市、山东、江苏、安徽、河南、湖北、陕西、山西、四川、甘肃、青海、宁夏、内蒙古和新疆。在新疆、甘肃、四川、陕西、山西和内蒙古6省、自治区，黑热病从来没有消失过。

防治利什曼病，世界卫生组织把疫苗的研发列为重要策略任务。过去有三代抗利什曼原虫疫苗曾经进入到或正在临床试验阶段，但目前均没有证据达到世界卫生组织的有效性。第一代抗利什曼原虫疫苗包括三个主要类型：完整杀死寄生虫、部分分离利什曼原虫抗原、减毒活病原体。完整杀死利什曼原虫疫苗成本低，在人体内成功应用于I期和II期临床试验，充分证明了其安全性和免疫原性；然而，该疫苗未能在随机临床试验(RCT)的III期取得令人满意的结果。部分分离利什曼原虫抗原疫苗和减毒活病原体疫苗主要用于犬利什曼病的防控。通过基因工程细胞产生的重组蛋白被称为“第二代疫苗”。典型代表是LEISH-F1，原名Leish-111f，已进入临床二期。这种人工蛋白是由三个基因编码：硕大利什曼原虫的真核硫醇特异性抗氧剂(L.major homologue of eukaryotic thiol-specificantioxidant,TSA)，硕大利什曼原虫应激诱导蛋白1(L.major stress-inducibleprotein-1,LmSTI1)，和L.braziliensis伸长和起始因子(L.braziliensis elongationand initiation factor,LeIF)。LEISH-F3是另一种多组分疫苗，由两种蛋白质组成：核苷水解酶(nucleoside hydrolase,NH)和甾醇24-c-甲基转移酶(sterol 24-c-methyltransferase,SMT)。第三代疫苗的代表是ChAd63，一种猿猴腺病毒载体疫苗(ChAd63)可以有效地诱导广泛的CD8+T细胞。这种疫苗编码KH基因，由两个杜氏利什曼原虫抗原基因组成：KMP-11和HASPB。研究表明，ChAd63-KH能有效诱导干扰素-γ的产生和树突状细胞的活化。