[发明专利]一步法富集含有NAD帽修饰的RNA

说明书

本发明提出了一步法富集含有NAD帽修饰的RNA，具体地，本发明提出了一种富集NAD帽修饰的RNA的方法，其特征在于，将式(I)所示化合物与待测RNA在腺苷二磷酸核糖基环化酶存在的条件下进行接触，以便使得式(I)所示化合物与所述待测RNA中含有NAD帽修饰的RNA进行结合，通过亲和处理，以便获得NAD帽修饰的RNA，X‑L‑B(I)，其中，X代表亲核基团，L代表连接基团，B代表生物素或脱硫生物素，X与B通过L相连。该方法操作简单，成本低廉。

技术领域

本发明涉及生物领域，具体地，本发明涉及一步法富集含有NAD帽修饰的RNA。

背景技术

真核细胞中的信使核糖核酸(以下简称：mRNA)通常具有5’端帽子修饰。长期以来，7-甲基鸟苷酸(以下简称：m7G)被认为是真核细胞mRNA唯一的帽子修饰。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(以下简称：NAD)是细胞中重要辅酶因子。最新研究发现，NAD也可作为RNA 5’端帽子修饰(以下简称：NAD-RNA)。NAD-RNA在原核和真核生物体中广泛存在，表明其有可能参与基因调控。NAD是细胞氧化及多种代谢通路的核心辅酶，且NAD在自然衰老和衰老相关疾病过程中发生显著下降。系统表征NAD-RNA的类型及丰度，为理解细胞生理及病理提供重要线索。

发明内容

发明人发现，目前现有技术中有两种方法用来富集含有NAD帽修饰的RNA。其中一种方法是利用NAD captureSeq技术，即在腺苷二磷酸核糖基环化酶(以下简称：ADPRC)的条件下利用4-戊炔-1-醇将NAD的烟酰胺部分替换为含炔烃的分子，然后通过点击化学反应(铜催化的叠氮-炔烃环加成CuAAC)将炔基化产物与生物素叠氮化物连接，并用链霉亲和素树脂富集生物素标记的RNA，最后通过二代测序技术(NGS)得到cDNA文库。该技术的缺点主要有两个：(1)金属铜离子的参与会导致RNA的严重降解导致RNA全长信息丢失，从而大大降低检测效率；(2)对于含有m7G帽子的RNA发生非特异性富集，从而影响NAD-RNA检测准确性。另一种方法SPAAC-NAD-seq检测技术，即分为三步：(1)通过抗体免疫共沉淀的方法去除含有m7G帽子的RNA；(2)利用ADPRC催化反应将3-叠氮基-1-丙醇将NAD的烟酰胺部分替换成为含叠氮化物；(3)通过炔烃环加成反应连接上生物素-PEG4-DBCO，进而用链霉亲和素树脂富集生物素标记的RNA，然后制备通过二代测序技术(NGS)测序得到cDNA文库。该技术的缺点也主要有两个：(1)步骤繁琐，多步反应降低总体检测效率；步骤1去除m7G帽子RNA后，需额外添加转运RNA(tRNA)以确保反应过程RNA总量不变；(2)多步反应造成RNA消耗，对RNA起始量要求高(不少于400微克总RNA)。

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。基于上述发现，本发明提出了无需金属铜离子，通过一步法富集含有NAD帽修饰的RNA的方法。本发明极大简化反应步骤，提高检测效率和准确性，且显著降低RNA用量。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种富集NAD帽修饰的RNA的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括将式(I)所示化合物与待测RNA在腺苷二磷酸核糖基环化酶存在的条件下进行接触，以便使得式(I)所示化合物与所述待测RNA中含有NAD帽修饰的RNA进行结合，通过亲和处理，以便获得NAD帽修饰的RNA，X-L-B(I)，其中，X代表亲核基团，L代表连接基团，B代表生物素或脱硫生物素，X与B通过L相连。需要说明的是，这里的亲和处理是常规的操作方法，可以为生物素或脱硫生物素基团与链霉亲和素树脂发生的特异性反应，从而达到亲和富集的效果。发明人发现，式(I)所示化合物的X为亲核基团，可以与RNA中的NAD帽上的烟酰胺基团发生亲核取代，替换烟酰胺基团，B基团为亲和基团，便于亲核取代反应后进行亲和纯化，不必再通过繁琐的步骤(比如点击化学)，简化操作过程并提高效率。

根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下技术特征至少之一：