[发明专利]一种微生物药敏的质谱检测方法

说明书

本发明公开一种微生物药敏的质谱检测方法。本发明质谱检测方法包括：设置抗生素处置组和无抗生素处置组两组，抗生素处置组用含有抗生素的培养基孵育培养待测微生物，无抗生素处置组用不含有抗生素的培养基孵育培养待测微生物；取两组孵育培养后的样品分别加入内标后进行质谱检测得到谱图，分别计算抗生素处置组和无抗生素处置组的谱图的曲线下面积，计算出RGR；根据RGR值的临界点进行待测微生物对相应抗生素的耐药或敏感的判断。本发明微生物药敏的质谱检测方法不需要预判微生物的耐药机制，灵敏度高，检测时间短，且不需要添加任何同位素，成本低，试验步骤简单。

技术领域

本发明涉及药敏检测技术领域。更具体地，涉及一种微生物药敏的质谱检测方法。

背景技术

传统微生物药敏试验方法是将微生物活菌与抗生素在液体培养基中进行混合，然后在自动加热孵育箱内进行培养，仪器根据液体培养基的浊度情况进行阳性报警，即液体培养基中有微生物生长后浊度增加，浊度增加到仪器检测范围内时，仪器可以报阳性，表示微生物对该种抗生素耐药，反之仪器不报警，表明微生物在含有该抗生素的培养基中无生长，即表示微生物对该种抗生素敏感，该方法细菌需要的阳性报警时间一般需要24～48h，分枝杆菌需要13d 6h±6d 5h。采用MALDI-TOF-MS对微生物的药敏检测手段目前主要有两个方向，一个是检测特征蛋白峰，这些特征蛋白峰为较确定的各种抗生素分解酶，如β-内酰胺酶；另一个方向是将细菌与抗生素共培养，然后检测培养基中的产物峰，这些产物峰为被分解后的抗生素片段，如果检测出抗生素碎片则说明细菌对抗生素进行了分解，表明其对该抗生素耐药。

传统微生物药敏试验方法满足CLSI浓度梯度法的检测原则，已经在临床诊断中采用，但用时太长。细菌(包括结核分枝杆菌)的耐药机制繁多，目前的MALDI-TOF-MS检测手段只能研究其中的一个方面，针对样本事先并不能判断其耐药机制。有一些产生的耐药性酶虽然可以确定，但分子量很大，超出质谱检测范围(一些耐药酶质量＞30 000Da)；而对产物的研究需要质谱在小分子范围有超高的灵敏度(抗生素质量一般＜1000Da)，这往往是需要两类质谱才能同时在大分子和小分子领域进行检测，目前基本没有质谱仪能够做到同时在大分子和小分子检测范围同时达到高分辨率。另外对结核分枝杆菌的耐药基因研究有一些其它方法(如PCR法)，操作复杂，污染率高，生物安全性差，样本通量差。

因此，需要提供一种新的微生物药敏的检测方法，以解决上述问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种微生物药敏的质谱检测方法，该方法不需要预判微生物的耐药机制，灵敏度高，检测时间短。

为达到上述目的，本发明首先提供了一种微生物药敏的质谱检测方法，所述质谱检测方法包括如下步骤：

设置抗生素处置组和无抗生素处置组两组，其中，抗生素处置组用含有抗生素的培养基孵育培养待测微生物，无抗生素处置组用不含有抗生素的培养基孵育培养待测微生物；

取两组孵育培养后的样品分别加入内标后进行质谱检测得到谱图，分别计算抗生素处置组和无抗生素处置组的谱图的曲线下面积，根据如下公式计算出RGR：

RGR＝AUC_{抗生素处置组}/AUC_{无抗生素处置组}；其中，AUC_{抗生素处置组}表示抗生素处置组的曲线下面积，AUC_{无抗生素处置组}表示无抗生素处置组的谱图的曲线下面积；

根据RGR值的临界点进行待测微生物对相应抗生素的耐药或敏感的判断。

进一步，所述抗生素的浓度为CLSI 2021药敏判断标准中的耐药节点浓度或者是所述耐药节点浓度以1～100倍稀释度稀释后的浓度，所述稀释后的浓度和CLSI 2021药敏判断标准中的耐药节点浓度成良好线性相关。具体的，所述抗生素的浓度为0μg/mL～125μg/mL。