[发明专利]利用显微注射技术在克隆胚早期发育阶段中瞬时表达目的蛋白的方法

说明书

本发明涉及动物克隆与胚胎工程技术领域，尤其涉及胚胎早期发育技术领域，具体涉及利用显微注射技术在克隆胚早期发育阶段中瞬时表达目的蛋白的方法。本发明利用显微注射技术在克隆胚早期发育阶段中瞬时表达目的蛋白的方法包括以下步骤：利用显微注射技术，向动物成熟卵母细胞中导入外源RNA；制备重构胚；体外培养所得的重构胚过程中，瞬时表达目的蛋白。本发明的方法能在早期胚胎发育过程中有效表达外源蛋白，又可避免原核注射DNA造成外源基因在供体细胞核基因组上的整合，为研究早期重构胚发育关键基因功能提供一种技术路径。

技术领域

本发明涉及动物克隆与胚胎工程技术领域，尤其涉及胚胎早期发育技术领域，具体涉及利用显微注射技术在克隆胚早期发育阶段中瞬时表达目的蛋白的方法。

背景技术

动物克隆是一种通过动物胚胎或体细胞核移植过程进行无性繁殖的技术。尤其自1996年通过体细胞核移植技术克隆出“多莉”羊以来，科研人员已制备了20多个物种的克隆动物，这为濒危动物资源保存、家养动物优异个体扩繁以及生物医学工程应用提供了广泛应用方向。猪是最为重要的农业动物之一，也是非常有价值的生物医学材料和人类疾病研究模型，使得克隆猪在农业、生物医学方向应用极为广泛前景。2005年，我国第一头自主完成的克隆猪在河北省三河市诞生，我国因此成为第7个拥有自主克隆猪能力的国家。

体细胞克隆技术已发展了20多年，主流的克隆胚重构技术包括传统克隆和手工克隆，传统克隆通常是指利用显微操作的方法，将供体细胞核注入预先去核的成熟卵母细胞内，经融合激活发育成新的重构胚；手工克隆技术是在体视显微镜下用特制的刀具将两个受体成熟卵母细胞核直接切除，再将供体细胞与其融合，经激活后发育成新的重构胚。手工克隆技术凭借其更低的成本和更高的效率得以快速、批量生产克隆动物，具备更广阔的产业化前景。尽管动物克隆在多个领域里取得一定的成果，但克隆产业化仍然受制于某些技术的瓶颈。例如，体细胞克隆猪，克隆胚胎移植到代孕母体后，仅有1％左右的重构胚会发育到个体。而影响了克隆成功率的重要因素之一便是重构胚发育成为囊胚效率和囊胚质量低下。所以，克服囊胚率低下在克隆产业中尤为关键。目前研究并未指出影响囊胚率低下的关键基因。现有技术采用显微注射法直接在克隆胚胎形成重构胚胎后，或者在受精卵中注射mRNA，该法可以产生瞬时表达目的蛋白，但是胚胎成活率很低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用显微注射技术在克隆胚早期发育阶段中瞬时表达目的蛋白的方法。

根据本发明具体实施方式的利用显微注射技术在克隆胚早期发育阶段中瞬时表达目的蛋白的方法，包括以下步骤：

(1)利用显微注射技术，向动物成熟卵母细胞中导入外源RNA；

(2)制备重构胚；

(3)体外培养步骤(2)所得的重构胚过程中，瞬时表达目的蛋白。

根据本发明具体实施方式的利用显微注射技术在克隆胚早期发育阶段中瞬时表达目的蛋白的方法，步骤(1)，包括以下步骤：

(1-1)从动物的卵巢中分离获取未成熟的卵母细胞；

(1-2)成熟培养卵母细胞；

(1-3)将培养好的卵母细胞收集到含有透明质酸酶消化液中，去掉卵丘层细胞，在体视显微镜下挑选胞质均匀、排出第一极体的成熟卵母细胞置于含有细胞松他素B的显微注射液液滴中，每个液滴为20μL，放置成熟卵母细胞10-20枚/滴，且覆盖石蜡油；

(1-4)将外源RNA注入卵母细胞中。

其中，可提供卵母细胞的动物包括猪、羊、牛、猫、狗、鼠、猴等。