[发明专利]利用显微注射技术在克隆胚早期发育阶段中瞬时表达目的蛋白的方法

权利要求书

1.利用显微注射技术在克隆胚早期发育阶段中瞬时表达目的蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)利用显微注射技术，向动物成熟卵母细胞中导入外源RNA；

(2)制备重构胚；

(3)体外培养步骤(2)所得的重构胚过程中，瞬时表达目的蛋白。

2.根据权利要求1所述的利用显微注射技术在克隆胚早期发育阶段中瞬时表达目的蛋白的方法，其特征在于，步骤(1)，包括以下步骤：

(1-1)从动物的卵巢中分离获取未成熟的卵母细胞；

(1-2)成熟培养卵母细胞；

(1-3)将培养好的卵母细胞收集到含有透明质酸酶消化液中，去掉卵丘层细胞，在体视显微镜下挑选胞质均匀、排出第一极体的成熟卵母细胞置于含有细胞松他素B的显微注射液液滴中，每个液滴为20μL，放置成熟卵母细胞10-20枚/滴，且覆盖石蜡油；

(1-4)将外源RNA注入卵母细胞中。

3.根据权利要求2所述的利用显微注射技术在克隆胚早期发育阶段中瞬时表达目的蛋白的方法，其特征在于，步骤(1-2)中，将未成熟的卵母细胞分配在预平衡好卵母细胞成熟液的四孔板中，于饱和湿度、5％CO₂、5％O₂的二气培养箱中，培养42-46小时，得到成熟的卵母细胞。

4.根据权利要求2所述的利用显微注射技术在克隆胚早期发育阶段中瞬时表达目的蛋白的方法，其特征在于，步骤(1-4)中，导入的外源RNA为mRNA，mRNA重悬于去RNA酶的无菌水中，mRNA工作浓度为100ng/μL，注射量为8-10pL mRNA/卵母细胞。

5.根据权利要求1所述的利用显微注射技术在克隆胚早期发育阶段中瞬时表达目的蛋白的方法，其特征在于，显微注射技术使用的注射针参数为P＝200,HEAT＝530,PULL＝60,VEL＝100,TIME＝200。

6.根据权利要求1所述的利用显微注射技术在克隆胚早期发育阶段中瞬时表达目的蛋白的方法，其特征在于，步骤(1)中，显微注射RNA时，固定针固定卵母细胞时，极体方向位于7点或11点方向。

7.根据权利要求1所述的利用显微注射技术在克隆胚早期发育阶段中瞬时表达目的蛋白的方法，其特征在于，制备重构胚的步骤包括：

(2-1)制备克隆供体细胞；

(2-2)卵母细胞去核；

(2-3)将两个卵母细胞与一个供体细胞进行两次胞质电融合，得到重构胚。

8.根据权利要求1所述的利用显微注射技术在克隆胚早期发育阶段中瞬时表达目的蛋白的方法，其特征在于，步骤(3)中，将重构胚放置于37℃预热平衡的、添加细胞松弛素B和放线菌酮的胚胎培养液中，在饱和湿度、5％O₂、5％CO₂浓度的三气培养箱中放置4-6h，清洗2-3遍后，放置饱和湿度、5％O₂、5％CO₂浓度的三气培养箱中培养2-6天。