[发明专利]一种用于检测犬乙型脑炎病毒抗体的胶体金试纸条及其制备方法

权利要求书

1.一种用于检测犬乙型脑炎病毒抗体的胶体金试纸条，其包括底衬卡，底衬卡之上从前到后依次粘贴样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中硝酸纤维素膜粘贴在底衬卡上，其上分布有重组犬乙型脑炎病毒EDⅢ抗原包被形成的检测带和羊抗兔IgG包被形成的质控带；所述的结合垫处于硝酸纤维素膜的前端，由胶体金颗粒喷涂于玻璃纤维膜上干燥制备得到；所述的样品垫处于结合垫的前端，用于点样；所述的吸水垫位于硝酸纤维素膜的后端，用于吸收样品中多余的水。

2.一种用于检测犬乙型脑炎病毒抗体的胶体金试纸条的制备方法，其包括如下步骤:

1)重组犬乙型脑炎病毒EDⅢ抗原的制备：将重组工程菌株接种到LB培养基中，37℃培养至吸光度A₆₀₀＝0.6时，向其中加入IPTG诱导培养，收集菌体并进行SDS-PAGE测定纯度，得重组犬乙型脑炎病毒EDⅢ抗原粗品；

2)重组犬乙型脑炎病毒EDⅢ抗原的纯化：将收集菌体超声裂解后溶于8mol/L尿素，离心收集上清液；使用Ni²⁺-NTA金属螯合蛋白质纯化柱纯化包含重组犬乙型脑炎病毒EDⅢ抗原的上清液，洗脱同时取20μL洗脱液样本进行SDS-PAGE凝胶电泳检测，收集目标洗脱液，得纯化后的重组犬乙型脑炎病毒EDⅢ抗原；

3)重组犬乙型脑炎病毒EDⅢ抗原的复性：将纯化后的重组犬乙型脑炎病毒EDⅢ抗原转入透析袋放入4℃透析液中，通过更换透析液透析至尿素浓度降至0.2mol/L；然后使用PBS缓冲液透析3次，3h/次；使用PEG 20000浓缩蛋白质，高速离心后收集上清液，NanoDrop定量测定浓度后置于-80℃保存备用；

4)重组犬乙型脑炎病毒EDⅢ抗原免疫层析试纸条的制备：制备胶体金结合垫；将重组犬乙型脑炎病毒EDⅢ抗原和羊抗兔IgG分别稀释至1mg/ml和1.2mg/ml，包被于硝酸纤维素膜上作为检测带和质控带，置于37℃干燥2h；将样品垫、结合垫、吸水垫依次贴在底衬卡上，切成宽度为0.4cm的条，装壳即得用于检测犬乙型脑炎病毒抗体的胶体金试纸条。

3.根据权利要求1所述的用于检测犬乙型脑炎病毒抗体的胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中IPTG的终浓度为1mmol/L，诱导培养时间为6小时。

4.根据权利要求1所述的用于检测犬乙型脑炎病毒抗体的胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，步骤4)中结合垫的制备方法包括如下步骤：采用柠檬酸钠还原法制备25nm的胶体金；将制备好的胶体金以0.1mol/L K₂CO₃调节pH至6.6～7.0后，按照1mL胶体金标记4μg葡萄球菌A蛋白，将其喷涂于玻璃纤维膜上，37℃干燥2h制备得到结合垫。

5.一种应用胶体金试纸条检测犬乙型脑炎病毒抗体的方法，其特征在于，其包括如下步骤：将血清样品稀释液和待检血清混匀，取100μL混合液滴加在样品垫上，20min左右依据判断标准对检测结果进行判断。

6.一种应用胶体金试纸条检测犬乙型脑炎病毒抗体的方法，其特征在于，所述的判断标准为：仅质控带出现红色，则结果为阴性；若质控带和检测带均出现红色，则结果为阳性；若质控带和检测带没有显色或者只有检测带显色，则试纸条已经失效，结果无效。

7.权利要求1所述的胶体金试纸条在检测犬乙型脑炎病毒抗体中的应用。