[发明专利]编码可溶性HPV58 L1蛋白的基因及其重组质粒的构建与应用

说明书

本发明公开了一种编码可溶性HPV58L1蛋白的基因及其重组质粒的构建与应用。本发明在综合多重复杂因素的基础上优化设计得到基因HPV58L1，并构建了重组质粒pUC‑58L1和pESUMO‑58L。本发明HPV58L1基因能显著提高目的蛋白可溶性表达的效率，且产物性质均一、性能稳定，其目的蛋白表达量可满足工业化生产的要求；本发明提供了一种低成本的原核表达可溶性HPV58L1蛋白的方法，该方法将HPV58L1蛋白与SUMO蛋白融合表达，可以获得可溶性好、具有明显血凝活性的重组表达蛋白。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉一种编码可溶性HPV58 L1蛋白的基因及其重组质粒的构建与应用。

背景技术

据统计，2018年全球宫颈癌新发病例57万例，死亡病例有31.1万例，是第四大最常的女性癌症，而高危型人乳头瘤病毒（High Risk Human papillomavirus, HR-HPV）的长期持续性感染是导致发生宫颈癌变的重要原因。人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus，HPV）是一类双链小分子DNA病毒，具有严格的种属特异性，主要感染人的皮肤和粘膜组织，具有高度的多样性和种属特异性，在地理和种族的分布方面呈现出明显的差异。HPV 58是最常见的致癌亚型之一；在全球范围内，HPV 58在宫颈癌病因中排到第六位，但是在东亚地区却流行更广，其检出率仅排在HPV 16与HPV 18之后排到第三位，占所有病例的10%～18%。除宫颈癌外，HPV感染还与肛门生殖器癌、头颈鳞状细胞癌和皮肤疣等疾病密切相关。

HPV是一类小型dsDNA病毒，其基因组大小为8000 bp左右，分子量约为5×10⁶道尔顿，直径为50～60nm，正二十面体结构。含有8个开放阅读框（Open reading frame，ORF），分别编码不同的蛋白质，根据其表达时间的不同，将其分为：早期区、晚期区和长控制区。早期区位于基因组的下游，编码参与病毒的复制与转录的非结构蛋白E1、E2、E4、E5、E6和E7。晚期区大小为2500 bp左右，编码L1和L2结构蛋白，二者共同组成了病毒的衣壳。L1蛋白是HPV的主要衣壳蛋白，由L1 ORF编码，由于L1 ORF的保守性非常高，因此作为HPV分型的依据。L1蛋白大小约为55～60 kDa。一般情况下，5个L1蛋白聚合形成5聚体，72个5聚体和一定数量的L2蛋白一同构成T=7的20面体结构的病毒衣壳。

有研究表明，L1蛋白在合适的条件下可以自组装形成病毒样颗粒（Virus likeparticles，VLP），目前所有获批上市的HPV预防性疫苗均是基于VLP研制的，但是由于相关疫苗选用杆状病毒表达系统研制，生产成本较高，价格昂贵而且保护亚型有限，在发展中国家和低收入地区的普及率较低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种编码可溶性HPV58 L1蛋白的基因及其重组质粒、重组工程菌，并构建了HPV58 L1蛋白表达方法，旨在提高HPV 58 L1蛋白的可溶性、活性及表达量，并降低其制备成本。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

基于野生型HPV58L1基因进行改造，对其所对应的氨基酸全部采用大肠杆菌中使用频率最高的核苷酸密码子；而且为了避免翻译出来的mRNA的GC比例过高，mRNA的二级结构对翻译效率造成影响，并避开一些常用的酶切位点，对最优的密码子频率进行修正；最终，在综合考虑多重复杂因素的基础上，研究设计出全新的HPV58 L1 DNA序列，如SEQ IDNO.1所示。

合成优化获得的HPV58L1 DNA基因装入pUC57质粒中，构成重组质粒pUC-58L1；并构建了重组质粒pESUMO-58L。

构建表达可溶性HPV58 L1蛋白的重组质粒的方法，包括如下步骤：