[发明专利]一种二代测序方法和文库构建方法

说明书

本申请公开了一种二代测序方法和文库构建方法。本申请的二代测序方法包括，将测序接头包埋进Tn5转座酶中，对待测DNA样本进行处理，一步获得片段化、末端修复和接头连接的样本，然后，终止Tn5酶促反应；采用带有双端barcode的引物组，对Tn5转座子处理产物进行PCR扩增；纯化扩增产物，对其测序，使用转录本组装软件和转录本丰度评估软件对下机数据进行组装和丰度评估，获得测序结果。本申请测序方法，流程简单快速，提高了测序成功率和组装结果质量，在样品有污染或样品含有复杂序列的时候仍能进行高质量测序；本申请方法既具有新一代测序的优点，又具有Sanger测序同样甚至更高的准确性，能替代Sanger测序。

技术领域

本申请涉及基因测序技术领域，特别是涉及一种二代测序方法和文库构建方法。

背景技术

双脱氧链终止法(dideoxyribonucleotide chain-termination method)，又称Sanger测序法(Sanger method)，是一种常用的核酸测序技术，用于DNA分析，由英国生物化学家Frederick Sanger于1977年发明。双脱氧链终止法采用DNA复制原理；在4个DNA合成反应体系(含dNTPs)中分别加入一定比例带有标记的ddNTPs，即分别为ddATP、ddCTP、ddGTP和ddTTP，通过凝胶电泳和放射自显影后，可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。由于ddNTPs的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应。双脱氧链终止法与化学降解法以及其衍生方法统称为第一代DNA测序技术，为人类基因组计划所使用主要测序方法，该技术直到现在依然被广泛使用，准确率高，被称为基因检测的金标准。但Sanger测序一次只能获得一条长度700-1000个碱基的序列，无法满足现代科学发展对生物基因序列获取的迫切需求。

高通量测序(High-Throughput Sequencing,HTS)是对传统Sanger测序的革命性变革，解决了一代测序一次只能测定一条序列的限制；高通量测序一次运行即可同时得到几十万到几百万条核酸分子的序列，因此也被称为新一代测序(Next GenerationSequencing,NGS)或第二代测序(即二代测序)。

目前，基因测序技术已经在众多领域得到广泛应用，包括生物的基因组图谱绘制、环境基因组学和微生物多样性、转录水平动态响应及其调控机制、疾病相关基因的确定和诊断、表观遗传学和考古学、物种进化演替过程等等。

虽然，就当前市场形势看来第二代测序技术在全球测序市场上占有绝对的优势地位；但是，Sanger测序准确率高，仍然被称为基因检测的金标准。目前Sanger测序的主要流程包括：1)分离纯化模板DNA、2)DNA模板定量分析、3)测序反应、4)测序反应后纯化、5)On-line变性、毛细管电泳和检测，以及6)数据分析。总的来说，Sanger测序的测序反应对起始模板DNA的浓度和纯度要求较高，对于有一定污染和有重复序列等特殊结构的样本，可能无法交付目标序列。并且，Sanger测序一次最多只能获得一条长度在700-1000bp的序列，通量较低。对于过短的PCR产物无法直接测序，需要克隆后进行测序。由于测试起始电压不稳，Sanger测序反应中引物结合位置以及后续50bp无法测出准确序列，所以较短的PCR样本的有效读长非常短，不建议直接测序。且因Sanger测序技术本身的限制，测序反应对环境的干扰比较敏感，过短的PCR产物测序受外界的干扰更大，很容易造成测序失败。

发明内容

本申请的目的是提供一种改进的二代测序方法和文库构建方法。

为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：

本申请的一方面公开了一种二代测序方法，包括以下步骤：

转座子制备步骤，包括将测序接头包埋进Tn5转座酶中，形成Tn5转座子；