[发明专利]一种检测禽白血病P27的间接ELISA方法

说明书

本发明公开了一种检测禽白血病P27的间接ELISA方法，利用禽白血病病毒RSA株p27基因序列设计一对引物以扩增p27基因，构建蛋白表达载体，通过IPTG诱导表达获得重组表达蛋白上清表达，以蛋白上清表达经纯化后作为包被抗原，建立检测禽白血病P27的间接ELISA方法。本发明建立的检测禽白血病P27的间接ELISA方法具有良好的敏感性和特异性，并且方法操作简单快速，成本较低，能够检测到禽白血病群特异性抗原，且与常见的禽类病毒不反应，为禽白血病的诊断、防控奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种检测禽白血病P27的间接ELISA方法，属于禽白血病检测技术领域。

背景技术

禽白血病(Avian leukosis,AL)是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)引起的鸡的肿瘤性疾病之一，自Roloff于1968年报道了欧洲发生的一例鸡“淋巴肉瘤”以来，禽白血病多发于禽类，给养禽业造成巨大的经济损失。p27蛋白是gag基因编码的禽白血病病毒的群特异性抗原，高度保守，是ALV 核心衣壳蛋白的主要成分，有许多易于检测的病毒抗原位点。在外源性ALV(A， B，C，D，J)各亚群间同源性高达90％。p27蛋白含量高，占病毒总蛋白成分的 30％以上，是制备检测抗体的首选抗原。

发明内容

基于上述，本发明提供一种检测禽白血病P27的间接ELISA方法，方法特异性及重复性好，敏感性高，具有良好的可靠性。

本发明的技术方案是：一种检测禽白血病P27的间接ELISA方法，利用禽白血病病毒RSA株p27基因序列设计一对引物以扩增p27基因，构建蛋白表达载体，通过IPTG诱导表达获得重组表达蛋白上清表达，以蛋白上清表达经纯化后作为包被抗原，建立检测禽白血病P27的间接ELISA方法。

可选的，所述禽白血病病毒为病毒RSA株。

可选的，所述一对引物的引物序列如下：

p27-EcoR I-F：CGGAATTCATGCCTGTAGTGATTAAGACAG；

p27-Xba I-R：GCTCTAGACCTAGGGCTGGATAGCAGAC。

可选的，具体步骤如下：

1)用禽白血病病毒RSA株p27基因序列设计一对引物以扩增p27基因，构建重组表达载体经诱导表达获得重组表达蛋白上清表达，上清表达经过纯化后作为包被抗原；

2)将包被抗原放入酶标板内进行包被、封闭，得封闭液；

3)甩掉步骤2)中封闭液，用一抗孵育，然后再用二抗孵育；

4)甩掉步骤3)中酶标二抗孵育液，采用TMB显色液显色，加入显色终止液，终止反应；

5)利用酶标仪测定步骤4)酶标板孔中液体OD₄₅₀nm值，根据临界值判定阴阳性。

可选的，步骤1)中，所述p27蛋白抗原浓度为0.5μg/mL。

可选的，步骤2)中，包被条件为37℃包被1h，封闭时间为37℃封闭1h。

可选的，步骤3)中，一抗为稀释倍数为1:200的待检测阴阳性血清，孵育条件为37℃作用0.5h；二抗为稀释倍数为1:5000的HRP标记兔抗鸡IgG，孵育条件为37℃作用0.5h。

可选的，显示条件为37℃作用10min。

可选的，所述临界值判定阴阳性的标准为：当OD₄₅₀nm大于0.481是阳性，小于0.481是阴性。