[发明专利]一种检测禽白血病P27的间接ELISA方法

权利要求书

1.一种检测禽白血病P27的间接ELISA方法，其特征在于，利用禽白血病病毒RSA株p27基因序列设计一对引物以扩增p27基因，构建蛋白表达载体，通过IPTG诱导表达获得重组表达蛋白上清表达，以蛋白上清表达经纯化后作为包被抗原，建立检测禽白血病P27的间接ELISA方法。

2.根据权利要求1所述的检测禽白血病P27的间接ELISA方法，其特征在于，所述禽白血病病毒为病毒RSA株。

3.根据权利要求1所述的检测禽白血病P27的间接ELISA方法，其特征在于，所述一对引物的引物序列如下：

p27-EcoR I-F：CGGAATTCATGCCTGTAGTGATTAAGACAG；

p27-Xba I-R：GCTCTAGACCTAGGGCTGGATAGCAGAC。

4.根据权利要求1所述的检测禽白血病P27的间接ELISA方法，其特征在于，具体步骤如下：

1)用禽白血病病毒RSA株p27基因序列设计一对引物以扩增p27基因，构建重组表达载体经诱导表达获得重组表达蛋白上清表达，上清表达经过纯化后作为包被抗原；

2)将包被抗原放入酶标板内进行包被、封闭，得封闭液；

3)甩掉步骤2)中封闭液，用一抗孵育，然后再用二抗孵育；

4)甩掉步骤3)中酶标二抗孵育液，采用TMB显色液显色，加入显色终止液，终止反应；

5)利用酶标仪测定步骤4)酶标板孔中液体OD₄₅₀nm值，根据临界值判定阴阳性。

5.根据权利要求4所述的检测禽白血病P27的间接ELISA方法，其特征在于，步骤1)中，所述p27蛋白抗原浓度为0.5μg/mL。

6.根据权利要求4所述的检测禽白血病P27的间接ELISA方法，其特征在于，步骤2)中，包被条件为37℃包被1h，封闭时间为37℃封闭1h。

7.根据权利要求4所述的检测禽白血病P27的间接ELISA方法，其特征在于，步骤3)中，一抗为稀释倍数为1:200的待检测阴阳性血清，孵育条件为37℃作用0.5h；二抗为稀释倍数为1:5000的HRP标记兔抗鸡IgG，孵育条件为37℃作用0.5h。

8.根据权利要求4所述的检测禽白血病P27的间接ELISA方法，其特征在于，步骤4)中，显示条件为37℃作用10min。

9.根据权利要求4所述的检测禽白血病P27的间接ELISA方法，其特征在于，所述临界值判定阴阳性的标准为：当OD₄₅₀nm大于0.481是阳性，小于0.481是阴性。