[发明专利]一种检测禽白血病群特异性抗原的双抗夹心间接ELISA方法

说明书

本发明公开了一种检测禽白血病群特异性抗原的双抗夹心间接ELISA方法，包括：1）用禽白血病病毒RSA株p27基因序列设计一对引物以扩增p27基因，构建重组表达载体经诱导表达获得重组表达蛋白上清表达，上清表达经过纯化后作为免疫原，制备兔源、鼠源多克隆抗体；2）对包被兔源多克隆抗体的酶标板进行洗涤，37℃封闭1h，洗板；3）加入待检血清进行孵育，洗板；4）加入鼠源多克隆抗体进行孵育，洗板；5）加入酶标二抗进行孵育，洗板；6）加入TMB显色液显色，最后加入显色终止液，终止反应；7）利用酶标仪测定步骤4）酶标板孔中液体OD₄₅₀nm值，根据临界值判定阴阳性。本发明具有制备周期短，成本低，特异性及重复性好，敏感性高，可靠性好等优点。

技术领域

本发明涉及一种检测禽白血病群特异性抗原的双抗夹心间接ELISA方法，属于禽白血病检测技术领域。

背景技术

禽白血病(Avian leukosis,AL)是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)引起的鸡的肿瘤性疾病之一，自Roloff于1968年报道了欧洲发生的一例鸡“淋巴肉瘤”以来，禽白血病多发于禽类，给养禽业造成巨大的经济损失。p27蛋白是gag基因编码的禽白血病病毒的群特异性抗原，高度保守，是ALV 核心衣壳蛋白的主要成分，有许多易于检测的病毒抗原位点。在外源性ALV(A， B，C，D，J)各亚群间同源性高达90％。p27蛋白含量高，占病毒总蛋白成分的 30％以上，是制备检测抗体的首选抗原。

发明内容

基于上述，本发明提供一种检测禽白血病群特异性抗原的双抗夹心间接 ELISA方法，方法制备周期短，成本低，特异性及重复性好，敏感性高，具有良好的可靠性。

本发明的技术方案是：一种检测禽白血病群特异性抗原的双抗夹心间接 ELISA方法，包括以下步骤：

1)用禽白血病病毒RSA株p27基因序列设计一对引物以扩增p27基因，构建重组表达载体经诱导表达获得重组表达蛋白上清表达，上清表达经过纯化后作为免疫原，制备兔源、鼠源多克隆抗体；

2)对包被兔源多克隆抗体的酶标板进行洗涤，37℃封闭1h，洗板；

3)加入待检血清进行孵育，洗板；

4)加入鼠源多克隆抗体进行孵育，洗板；

5)加入酶标二抗进行孵育，洗板；

6)加入TMB显色液显色，最后加入显色终止液，终止反应；

7)利用酶标仪测定步骤6)酶标板孔中液体OD450nm值，根据临界值判定阴阳性。

可选的，所述禽白血病病毒为病毒RSA株。

可选的，所述一对引物的引物序列如下：

p27-EcoR I-F：CGGAATTCATGCCTGTAGTGATTAAGACAG；

p27-Xba I-R：GCTCTAGACCTAGGGCTGGATAGCAGAC。

可选的，所述包被兔源多克隆抗体的浓度为4μg/mL，包被条件为37℃2h 后4℃过夜。

可选的，所述待检血清的反应条件为37℃作用1h。

可选的，所述鼠源多克隆抗体的稀释倍数为1:400，反应条件为37℃作用0.5 h。

可选的，所述酶标二抗的反应时间为37℃作用1h。

可选的，所述显示的条件为37℃作用20min.