[发明专利]用于靶向遗传修饰的方法和组合物，以及这些组合物的使用方法

权利要求书

1.一种修饰细胞中Y染色体上的靶基因组座位的方法，包括：

(a)提供在所述Y染色体上包含所述靶基因组座位的所述细胞，其中所述靶基因组座位包含核酸酶试剂的识别位点，并且其中所述细胞处于包含DMEM基础培养基的培养物中；

(b)向所述细胞引入：

(i)所述核酸酶试剂或编码所述核酸酶试剂的多核苷酸，其中所述核酸酶剂在所述识别位点诱导切口或双链断裂；以及

(ii)大靶向载体，所述大靶向载体包含插入多核苷酸，所述插入多核苷酸侧接第一同源臂和第二同源臂，所述第一同源臂和所述第二同源臂与位于所述靶基因组座位中的第一靶位点和第二靶位点相对应，其中所述第一同源臂和所述第二同源臂的总和为至少10kb，

并且其中所述靶向载体与所述靶基因组座位进行同源重组；以及

(c)鉴定至少一个在其基因组中包含在所述靶基因组座位整合的所述插入多核苷酸的细胞，其中所述插入多核苷酸的整合引入了遗传修饰，所述遗传修饰包括在所述靶基因组座位缺失内源核酸序列，并用外源核酸序列替换。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一同源臂和所述第二同源臂的所述总和小于150kb。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞，可选地，其中所述哺乳动物细胞来自啮齿动物，并且可选地，其中所述啮齿动物是大鼠或小鼠。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述细胞是多能细胞，可选地，其中所述多能细胞是诱导性多能干(iPS)细胞或非人胚胎干(ES)细胞，可选地，其中所述非人ES细胞是啮齿动物ES细胞、大鼠ES细胞或小鼠ES细胞。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述细胞是所述小鼠ES细胞。

6.根据权利要求1、2、5中任意一项所述的方法，其中所述核酸酶试剂为：

(a)锌指核酸酶(ZFN)；

(b)转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)；

(c)大范围核酸酶；

(d)成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关(Cas)蛋白和向导RNA(gRNA)；或

(e)编码核酸酶的mRNA。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述核酸酶试剂为Cas蛋白和gRNA，其中所述Cas蛋白为Cas9蛋白，其中所述gRNA包含：

(a)靶向所述识别位点的CRISPRRNA(crRNA)，其中所述识别位点紧邻地侧接前间区序列邻近基序(PAM)序列；和

(b)反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)。

8.根据权利要求1、2、5和7中任意一项所述的方法，其中所述插入多核苷酸的长度为5kb至400kb。

9.根据权利要求1、2、5和7中任意一项所述的方法，其中所述插入多核苷酸包含条件性等位基因、编码选择标记的多核苷酸、侧接位点特异性重组靶序列的核酸，或有效连接至启动子的报告基因，其中所述报告基因编码报告蛋白，所述报告蛋白选自由LacZ、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-Red、DsRed、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、Ypet、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)、Emerald、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)，CyPet、青色荧光蛋白(CFP)、Cerulean、T-Sapphire、萤光素酶、碱性磷酸酶及其组合组成的组。

10.根据权利要求1、2、5和7中任意一项所述的方法，其中所述遗传修饰包括结构域交换、外显子交换、内含子交换、调控序列交换、基因交换或其组合。

11.根据权利要求1、2、5和7中任意一项所述的方法，其中缺失的所述内源核酸序列为5kb至3Mb。