[发明专利]一种用于预测胃癌免疫治疗的肿瘤微环境评分系统的构建方法以及分子探针

说明书

本发明提供了一组用于检测评估肿瘤微环境的基因集的分子探针，包括44条序列如SEQ ID NO:1～44所示的核苷酸序列。本发明筛选出的探针，在同一孔中对目的基因的表达进行NanoString数字化表达检测，绘制数字基因表达谱，可用于免疫治疗效果的评估。本发明还提供了用于评价胃癌肿瘤微环境的多基因评分模型的构建方法，筛选出得到的44个可代表不同微环境分型的基因集，可用于建立评估患者的肿瘤微环境多基因评分模型。本发明模型通过有效地评估肿瘤微环境，不仅能作为良好的预后生物标志物，还能够预测多种肿瘤的检查点抑制剂免疫治疗反应，对于实现个体化医疗的同时节约医疗资源，具有重要的意义和临床应用价值。

技术领域

本发明属于生物信息领域，涉及评估肿瘤微环境的基因集、评分系统的构建方法以及检测基因集各基因表达水平的分子探针。

背景技术

胃癌是我国居民高发的恶性肿瘤，根据GLOBOCAN 2012年的数据显示，中国新增的胃癌病例占全球发病总数的42.5％，死亡病例数占全球45％。晚期胃癌患者预后差，一线化疗后复发或疾病进展发生率高，患者生存率低，同时可选择的后线治疗手段有限。免疫治疗最大的挑战在于只有部分患者才能从中获益，如何精准得筛选出能从检查点抑制剂中获益的患者群体，是胃癌免疫治疗面临的最大挑战。迄今为止，用于预测PD-1/PD-L1单抗疗效的生物标志物包括PD-L1的免疫组化表达水平(CPS)，高度微卫星不稳定性(MSI-H)和肿瘤突变负荷(TMB)。

然而，PD-L1作为生物标志物预测检查点抑制剂疗效存在局限性。比如帕博利珠单抗开展的KEYNOTE-061研究，比较帕博利珠单抗与紫杉醇在PD-L1CPS≥1的晚期胃/胃食管结合部腺癌二线治疗中的疗效，遗憾的是，在总体人群中，帕博利珠单抗对比紫杉醇，PFS和OS未达到统计学差异，亚组分析提示可能需要在生物标志物上进一步探索人群。此项三期的临床随机对照研究表明，PD-L1的表达水平存在局限性：①PD-L1在肿瘤中的表达存在异质性，不同瘤种以及同一肿瘤的不同区域，肿瘤病灶和转移灶之间都可存在PD-L1的表达差异；②抗体和染色情况缺乏标准化，PD-L1表达水平主要通过免疫组化染色情况进行评估。而目前临床研究中用于PD-L1免疫组化染色的抗体不一，染色情况也受制于评估者的主观判断；③关于PD-L1有效性的界定标准模糊，PD-L1表达强度，即多少百分比判定为“阳性”存在争议。在KEYNOTE-010研究中证实了PD-L1表达水平(＞50％)与临床获益之间的相关性。PD-L1 28-8 pharm Dx(Dako)IHC检测在晚期NSCLC和接受纳武利尤单抗的黑素瘤患者中被批准，其评分系统定义PD-L1表达＜1％为阴性，低表达为1％-5％，中间表达为5％-10％，高表达为＞10％。

微卫星是短DNA序列的串联重复序列，在真核生物的基因组中广泛存在。人类错配修复基因(MMR基因)经转录翻译后可表达相应的错配修复蛋白，如果任一MMR蛋白表达缺失可造成细胞的错配修复功能缺陷，则对DNA复制过程中的碱基错配丧失修复功能而造成累积，导致微卫星不稳定(MSI)的发生。2017年，美国FDA批准PD-1抑制剂帕博利珠单抗治疗微卫星高度不稳定(MSI-H)/错配修复缺陷(dMMR)的实体瘤患者，瘤种覆盖结直肠癌、胃癌、非小细胞肺癌等15个不同部位的恶性肿瘤。然而，尽管这类患者可通过免疫治疗获益，却只占所有胃癌患者的6％，且在晚期胃癌中发生率低，并不能适用于大多数胃癌患者；除此之外，CheckMate-032(I/II期)研究显示，Nivolumab的疗效与MSI无关，其单药在MSI-H和non-MSI-H均表现出临床疗效和总生存获益。

肿瘤突变负荷(TMB)定义为肿瘤基因组中每个编码区的突变总数，其范围包含几个到数千个突变。越来越多证据表明，对检查点抑制剂与多种肿瘤的高肿瘤突变负荷相关。然而,首个证实TMB可作为免疫治疗效果预测标志物的前瞻性临床研究CHECKMATE-227在2019年3月更新的随访数据结果显示，TMB水平与最终的患者生存结果不相关。除此之外，两项对比非小细胞肺癌一线化疗与免疫治疗优劣性的临床研究，KEYNOTE-021和KEYNOTE-189的研究结果表明，不同肿瘤突变负荷的患者疗效表现一致。