[发明专利]一种小鼠食管鳞癌细胞系及其建立方法和应用

说明书

本发明属于肿瘤细胞系的技术领域，具体涉及一种小鼠食管鳞癌细胞系及其建立方法和应用。包括如下步骤：1)小鼠原位食管鳞癌模型建立：采用化学试剂诱导小鼠食管粘膜细胞癌变；2)小鼠食管鳞癌细胞系培养：将上述肿瘤组织用无血清培养基清洗，切块，置于含有20％FBS的DMEM培养基，恒温培养；将有细胞爬出的组织块继续培养，清洗，加入胰酶消化，离心取上清，将细胞沉淀重悬后重新铺于培养瓶中，培养即得到小鼠食管鳞癌稳定细胞系；在较短的时间内获得能稳定传代的小鼠食管鳞癌细胞系，并且具有良好的成瘤性，是一种快速构建具有健全免疫微环境的小鼠食管鳞癌细胞模型的方法，获得的细胞系用于体外稳定培养，并且能够反复多次使用。

技术领域

本发明属于肿瘤细胞系的技术领域，具体涉及一种小鼠食管鳞癌细胞系及其建立方法和应用。

背景技术

食管癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率及死亡率在全球均位居所有癌种中的第六位。我国是食管癌发病率较高的国家，全世界超过一半的病例发生在我国。在中国，食管癌最主要的组织类型是鳞状细胞癌。手术是可切除食管鳞癌的重要的治疗手段，对于中晚期病例，术后辅助治疗亦被认为是需要的。此外，新辅助放化疗已被证明对于提高食管鳞癌病人生存期具有明显效果。然而，术后复发及转移仍是困扰临床医生的难题，探索新的治疗方法日益迫切，随着肿瘤免疫研究的深入，免疫治疗已成为一种重要的新兴疗法，其已被中国临床肿瘤学会(CSCO)推荐为食管癌的二线治疗方案，并在其它多种癌症中表现出良好的治疗效果。然而，治疗有效率低成为免疫治疗的重大阻碍，目前关于食管癌免疫治疗的研究比较局限于临床资料，缺少必要的基础实验。其原因在于缺乏稳定的小鼠来源的食管癌细胞系，若将人食管癌细胞接种于免疫功能缺陷的裸鼠，则无法在动物体内构建出健全的食管癌免疫微环境，在一定程度上限制了免疫治疗的发展。

因此，尝试建立稳定可靠的小鼠食管癌模型或细胞系已成为多个学者的共同目标。其中，通过化学致癌剂或基因突变构建小鼠原发食管癌模型已有报道。例如，在《中华实验外科杂志》2011版第28卷第9期报道的《4-硝基喹啉-1-氧化物饮水法构建BALB/C小鼠胃癌及食管癌模型》，苏州大学学报(医学版)2010版第30卷第5期报道的《4NQO诱发C57BL/6小鼠舌癌及食管鳞状细胞癌模型的建立》，及国际肿瘤学杂志2013年12月第40卷第12期的综述《食管癌小鼠模型研究进展》中，都对用-硝基喹啉-1-氧化物(4NQO)诱导小鼠食管癌模型进行了介绍。这个方法的主要步骤是用含4NQO的水持续喂养小鼠16个星期后，改用无菌水喂养12-16个星期，直至小鼠食管癌变。

来自深圳大学的专利CN110419505A公开了一种小鼠食管癌模型及其建立方法，其首先通过用4NQO诱导小鼠产生原发的食管癌，得到食管癌原位肿瘤组织，然后将该组织移植于裸鼠皮下进行体内培养，得到移植组织后，再将组织解离成单细胞，通过快速贴壁法及快速消化法去除成纤维细胞，上皮培养法富集上皮肿瘤细胞，最后获得小鼠食管癌细胞系，根据其构建出的细胞系，虽具有一定的成瘤性，可直接用于皮下成瘤构建异位的食管癌模型。但所建立的细胞系可能并不稳定，只是传了五代，无法在体外长期培养，这可能是肿瘤细胞纯度不高的缘故，同时也难以开展相关体外实验，并且其建立方法的操作步骤较为繁琐。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种小鼠食管鳞癌细胞系及其建立方法和应用，在较短的时间内获得能稳定传代的小鼠食管鳞癌细胞系，并且具有良好的成瘤性，是一种快速构建具有健全免疫微环境的小鼠食管鳞癌细胞模型的方法。

本发明的技术内容如下：

本发明还提供了一种小鼠食管鳞癌稳定细胞系的建立方法，包括如下步骤：

1)小鼠原位食管鳞癌模型建立：

将4-NQO原液稀释，用于诱导C57BL小鼠食管粘膜细胞癌变，之后取肿瘤组织，将肿瘤组织浸泡于含有双倍双抗的无血清DMEM培养基中；

2)小鼠食管鳞癌细胞系培养：