[发明专利]基于催化发夹自组装恒温扩增技术检测核酸的通用探针及其应用

说明书

本发明属于分子生物学技术领域，公开了基于催化发夹自组装恒温扩增技术检测核酸的通用探针及其应用。该通用探针，包含发夹探针H1和发夹探针H2；所述发夹探针H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述发夹探针H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。该通用探针可用于各种目标核酸的检测，无需根据目标核酸的改变重新设计。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及基于催化发夹自组装恒温扩增技术检测核酸的通用探针及其应用。

背景技术

乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤。根据2020年全球癌症统计，女性乳腺癌已经超过肺癌，成为发病率最高的癌。由于乳腺癌病因尚不明确，早期诊治是降低乳腺癌死亡率、提高乳腺癌患者生存质量的关键。外泌体是活细胞分泌的可以进入体液循环的细胞外囊泡，具有圆形或杯状脂质双分子层结构，粒径为40～160nm之间，广泛存在于体液中，包括血液、尿液乳汁等。外泌体通过携带亲本细胞的一些蛋白质、RNA、DNA等物质可以反映亲本细胞的表型状态，特别是肿瘤细胞。肿瘤细胞分泌的外泌体在外周血中浓度明显高于非癌性细胞的外泌体，是研究肿瘤诊断生物标志物的宝贵来源。而众多研究表明，分泌到循环系统中的外泌体包裹的miRNA/piRNA是疾病诊断的一种新型分子标志物。microRNA是一类18～24个核苷酸的非编码单链，在翻译水平上调控基因的表达。而piRNA是一类24～32个核苷酸，和Argonatue蛋白的PIWI亚家族相互作用，在表观遗传基因蛋白调控中起重要作用。众多研究表明，microRNA/piRNA的表达情况和人类多种恶性肿瘤的发生、发展、诊断预后相关，稳定存在于体液中的microRNA约有90％是包裹于外泌体中，因此说外泌体中的microRNA、piRNA被认为是潜在的疾病生物标志物。

目前检测RNA的方法主要有Northern blot、基因微阵列、实时定量荧光PCR(RT-qPCR)、基因表达系列分析、原位杂交、高通量测序、电化学分析等方法，每一种方法都各有长短，但上述方法应用于不易获得的微量外泌体样本中痕量RNA测定时，仍需要一系列程序，如外泌体裂解、RNA提取分离、cDNA合成等，对外泌体样品消耗量较大，且步骤繁琐耗时，精密度较差，从而影响结果的准确度和可靠性。因此，寻找一种操作简便、选择性高、准确廉价、无需分离前处理而能直接检测循环外泌体中痕量标志物的有效方法非常必要。催化发夹自组装(Catalytic Hairpin Assembly，CHA)作为一种等温核酸自组装扩增技术，是一种能够放大信号的DNA循环回路。在微量目标核酸短链存在的情况下，通过toehold介导的链置换反应，使两种互补的亚稳定核酸发夹结构发生循环杂交自组装反应，产生大量双链DNA产物，以产物中标记的荧光基团信号强度或变化指示目标核酸的含量。由于CHA反应具有设计简单，背景低，周转率高的特点，目前已广泛应用于各种痕量检测物的扩增分析，主要包括核酸和蛋白质。而传统的CHA扩增技术也存在着一定的局限性，如扩增所需的H1和H2寡核苷酸发夹结构的序列需根据检测目标microRNA的序列来设计，每改变一个检测目标核酸，则需重新设计合成不同的H1和H2序列并优化反应条件，繁琐耗时，不适用于高通量筛查。同时，尚无将CHA扩增技术用于piRNA检测的报道。

发明内容

本发明第一方面的目的，在于提供一组基于催化发夹自组装恒温扩增技术检测核酸的通用探针。

本发明第二方面的目的，在于提供一种包含本发明第一方面的通用探针的试剂盒。

本发明第三方面的目的，在于提供本发明第一方面的通用探针和/或第二方面的试剂盒在检测核酸中的应用。

本发明第四方面的目的，在于提供一种检测核酸的方法。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供一组通用探针，包含发夹探针H1和发夹探针H2；所述发夹探针H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述发夹探针H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。