[发明专利]一种抗体荧光探针及其制备方法和在可视化细胞检测中的应用

说明书

本发明公开了一种抗体荧光探针及制备方法和在可视化细胞检测中的应用，所述抗体荧光探针是将抗体标记物与单克隆抗体偶联，再将偶联单克隆抗体后的抗体标记物与自淬灭荧光基团偶联制得；所述抗体标记物是与单克隆抗体氨基末端特异性偶联的分子；所述自淬灭荧光基团在二聚体状态处于淬灭状态。本发明所提供的膜蛋白的检测方法以修饰的抗体为基础，所使用的仪器为实验室常规的共聚焦荧光显微镜，检测过程操作简单，且可以实现对膜蛋白的动态、半定量特异性监测，可以直观地标记活细胞中的膜蛋白且不改变蛋白本身的功能特点，因此在膜蛋白结构功能的研究、以膜蛋白为检测对象的疾病诊疗中发挥辅助作用。

(一)技术领域

本发明涉及一种抗体荧光探针及制备方法和在可视化细胞检测中的应用。

(二)背景技术

细胞膜蛋白家族可以维持细胞稳态，并参与细胞代谢过程。部分过表达的膜蛋白常常预示与肿瘤的发生发展相关，但它们参与细胞代谢的具体机制并不十分明确，因此针对细胞特异性的膜蛋白的检测在癌症的机理研究、临床诊断和治疗中均具有重要参考意义。常规的针对细胞膜蛋白的检测主要通过设计蛋白靶向的小分子探针，以实现对特异性膜蛋白的可视化检测，但这种方式不具备通用性，需要对靶标逐一设计、筛选具有特异性识别功能的功能性小分子。目前仍缺乏一种可直接适用于所有活细胞膜蛋白家族的特异性检测方法。相比于小分子靶向化合物，抗体是一类对特定膜蛋白具有特异性结合能力的生物蛋白制剂，具有靶向性明确、不良反应弱等优点。本发明利用抗体的这一特异性靶标结合能力，设计了一种通用的活细胞免疫成像方法，对目标蛋白进行实时、半定量的可视化检测，可迅速、直观地评价不同细胞中该蛋白的表达水平、细胞分布情况，为疾病诊断(如肿瘤样本的分子分型)和药效评价(如用药后该蛋白的含量和分布变化)提供有效检测工具。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种抗体荧光探针及制备方法和在可视化细胞检测中的应用，用于活细胞膜蛋白的半定量荧光检测；该方法通过在抗体中引入自淬灭的荧光团，构建对细胞膜蛋白具有特异性识别能力的淬灭状态的抗体探针，探针与活细胞膜蛋白相互作用后转变为荧光开启状态，从而可视化活细胞中膜蛋白的定位和表达情况。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种抗体荧光探针，所述抗体荧光探针是将抗体标记物与单克隆抗体偶联，再将偶联单克隆抗体后的抗体标记物与自淬灭荧光基团偶联制得；所述抗体标记物是与单克隆抗体氨基末端特异性偶联的分子；所述自淬灭荧光基团在二聚体状态处于淬灭状态。

所述抗体标记物包括基于苯甲醛和吡啶醛等可以与单克隆抗体氨基末端发生特异性连接的化学基团，优选为式(Ⅰ)所示含有不同乙二醇数量的聚乙二醇炔6-(哌嗪-1甲基)-2-吡啶甲醛，其中n＝1-10的正整数，优选为n＝5：

本发明所述式(Ⅰ)所示抗体标记物按如下方法制备：

(1)Alk_n-NO₂中间体的制备

将式(Ⅱ)所示聚乙二醇单(2-丙炔基)醚(记为Alk-PEG_n，n表示聚乙二醇的数量，为2-10的正整数)溶于用无水二氯甲烷，在0℃下，加入4-硝基苯基氯甲酸酯和吡啶，室温搅拌反应过夜；反应液用二氯甲烷稀释后，用饱和硫酸铜水溶液萃取(优选1-3次)，有机相经无水MgSO₄干燥、抽滤、滤液浓缩至无液体流出，获得浓缩物；将浓缩物用二氯甲烷溶解后，采用硅胶柱层析色谱法纯化，以体积比1：2-3的乙酸乙酯：石油醚为洗脱液，使用薄层监测(展开剂根据产物定，优选以体积比1：1的乙酸乙酯：石油醚为展开剂)，收集目标产物(优选Rf值为0.3-0.6)，旋干，得到白色固体，即为式(Ⅲ)所示中间体4-硝基苯基(2-丙炔-聚乙二醇-甲酯)(记为Alk_n-NO₂，n表示聚乙二醇的数量，为2-10的正整数)；

(Ⅱ)

(Ⅲ)