[发明专利]一种抗体荧光探针及其制备方法和在可视化细胞检测中的应用

权利要求书

1.一种抗体荧光探针，其特征在于所述抗体荧光探针是将抗体标记物与单克隆抗体偶联，再将偶联单克隆抗体后的抗体标记物与自淬灭荧光基团偶联制得；所述抗体标记物是与单克隆抗体氨基末端特异性偶联的分子；所述自淬灭荧光基团在二聚体状态处于淬灭状态；

所述抗体标记物包括式(Ⅰ)所示含有不同乙二醇数量的聚乙二醇炔6-(哌嗪-1甲基)-2-吡啶甲醛，n＝1-10的正整数；

2.如权利要求1所述的抗体荧光探针，其特征在于所述抗体标记物按如下方法制备：

(1)中间体的制备

将式(Ⅱ)所示聚乙二醇单(2-丙炔基)醚溶于用无水二氯甲烷，在0℃下，加入4-硝基苯基氯甲酸酯和吡啶，室温搅拌反应过夜；反应液用二氯甲烷稀释后，用饱和硫酸铜水溶液萃取，有机相经无水MgSO₄干燥、抽滤、滤液浓缩至无液体流出，获得浓缩物；将浓缩物用二氯甲烷溶解后，采用硅胶柱层析色谱法纯化，以体积比1：2-3的乙酸乙酯：石油醚为洗脱液，使用薄层层析监测，收集目标产物，旋干，得到白色固体，即为式(Ⅲ)所示中间体4-硝基苯基(2-丙炔-聚乙二醇-甲酯)；

(Ⅱ)

(Ⅲ)

式(Ⅱ)、式(Ⅲ)中n＝1-10的正整数；

(2)式(Ⅰ)所示抗体标记物的制备

将6-(哌嗪-1-甲基)-2-吡啶甲醛和N,N-二异丙基乙胺溶于无水二氯甲烷，加入式(Ⅲ)所示中间体，在室温下搅拌反应过夜；反应液减压浓缩至无液体流出后，获得浓缩物；将浓缩物用二氯甲烷溶解后，采用硅胶柱层析色谱法纯化，以体积比10:1-8的二氯甲烷和乙腈为洗脱液，使用薄层层析检测，收集目标产物，减压浓缩至无液体流出后得到式(Ⅰ)所示抗体标记物。

3.如权利要求2所述的抗体荧光探针，其特征在于步骤(1)中无水二氯甲烷体积用量以聚乙二醇单(2-丙炔基)醚物质的量计为1-10ml/mmol；所述聚乙二醇单(2-丙炔基)醚与4-硝基苯基氯甲酸酯和吡啶投料物质的量之比分别为1:2-8和1:2-8。

4.如权利要求2所述的抗体荧光探针，其特征在于步骤(2)6-(哌嗪-1-甲基)-2-吡啶甲醛与N,N-二异丙基乙胺物质的量之比为1:1-10；所述6-(哌嗪-1-甲基)-2-吡啶甲醛与式(Ⅲ)所示中间体投料物质的量之比为1：1-5；所述无水二氯甲烷体积用量以6-(哌嗪-1-甲基)-2-吡啶甲醛物质的量计为20-80ml/mmol。

5.如权利要求2所述的抗体荧光探针，其特征在于步骤(1)硅胶柱层析采用硅胶柱的规格为直径1-5cm，高度为15-50cm高硅胶柱，硅胶是指200-300目柱层析硅胶粉，填充高度为8-12cm，洗脱速度为5-8ml/min，洗脱3-10个柱体积。

6.如权利要求1所述的抗体荧光探针，其特征在于所述自淬灭荧光基团为叠氮基磺胺罗丹明B；所述单克隆抗体包括西妥昔单抗、耐昔妥珠单抗、利妥昔单抗、曲妥珠单抗或贝伐珠单抗。