[发明专利]用于检测LSDV的引物和试剂盒

说明书

本发明属于检测技术领域，公开了用于检测LSDV的引物和试剂盒，本发明通过检测LSDV RPO30基因，借助ERA技术，结合荧光探针的特性，构建出能够检测LSDV的ERA方法，其最低检测限为1×10²拷贝/μL。综上所述，本研究建立的LSDV RPO30的检测方法，42℃恒温条件15分钟即可实现对目的片段的有效扩增，具有操作简单、敏感性高、特异性强和快速等优点，适用于现场和基层检测。

技术领域

本发明涉及检测技术领域，更具体地，涉及用于检测LSDV的引物和试剂盒。

背景技术

牛结节性皮肤病(Lumpy skin disease，LSD)，也被称为牛疙瘩皮肤病、牛结节疹或牛结节性皮炎，是一种重要的以牛为主要自然宿主和传染源的痘病毒疾病，是由痘病毒科(Poxviridae)脊椎动物痘病毒亚科(Chordopoxvirinae，ChPV)山羊痘病毒属(Capripoxvirus，CaPV)牛结节性皮肤病病毒(Lumpy skin disease virus，LSDV)引起的。通常情况下，LSDV在常温下可以长时间存活，尤其在干燥的结痂中可以存活35天，非常稳定。此外，LSDV在风干的兽皮中至少存活18天，在坏死的皮肤结节中能存活长达33天甚至更久。该病毒还对紫外线和含有脂质溶剂的洗涤剂较敏感。

对于牛结节性皮肤病目前并没有好的免疫方法和治疗措施，只能通过快速检测来控制疫情的发展，目前对于LSDV的诊断方法主要包括临床检查、常规聚合酶链式反应(PCR)，实时荧光定量PCR，高分辨率熔解(high-resolution melting，HRM)曲线分析法，环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)和重组酶聚合酶扩增法(recombinase polymerase amplification，RPA)。免疫学方法能定性、定量检测血清抗体或感染性抗原，是LSD实验室诊断的重要依据，可取牛结节或活检样品研磨液、破溃结节内浆液、眼鼻分泌物、血清等进行检测。OIE推荐应用病毒中和试验(virus neutralizationtest，VNT)检测LSDV特异性血清抗体。该方法也适用于LSD群流行病学调查和疫苗免疫保护效果评价等。此外，已有商品化酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒用于羊痘病毒属的检测，但不能进行属内不同种病毒的区分。

上述检测方法要么需要专业的技术人员操作，要么检测时间和程序较为复杂，不适合现场快速检测。

发明内容

本发明为了克服现有技术中缺乏LSDV的现场快速检测方法，首先提供用于适用于现场快速检测的LSDV的引物和探针。

本发明的第二个目的是提供含有上述引物和探针的试剂盒。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

用于检测LSDV的ERA引物和探针，所述引物为RPO30-ERA-F1、RPO30-ERA-R1，序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，所述探针为RPO30-ERA-probe，序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明还提供用于检测LSDV的ERA试剂盒，包含所述的引物和探针。

优选的，所述的试剂盒还包括激活剂和溶解剂；均来自基础型核酸扩增试剂盒。

优选的，所述试剂盒的反应体系：探针0.72μL、引物RPO30-ERA-F1 2.1μL、引物RPO30-ERA-R1 2.1μL、模板2μL、激活剂2μL、溶解剂20μL、ddH₂O 21.08μL。

优选的，所述试剂盒的反应温度为42℃。