[发明专利]特异性结合CEA的核酸适配体及其应用

权利要求书

1.一种特异性结合CEA的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的序列如SEQ IDNO.1所示。

2.根据权利要求1所述的特异性结合CEA的核酸适配体引物，其特征在于，所述引物序列如下：

上游引物：5’-TGCGCTCTAGAGACGAAT-3’；

下游引物：5’-GTATACCTGCAGCTGAGG-3’；

生物素标下游引物：5’–Biotin-GTATACCTGCAGCTGAGG-3’。

3.根据权利要求1所述的特异性结合CEA的核酸适配体筛选方法，其特征在于，将CEA胞外区序列构建入表达载体pDisplay，重组质粒命名为pDisplay-CEA，重组质粒转染Cos-1细胞，经过G418筛选获得稳定表达CEA的细胞株；对称PCR扩增，核酸PAGE电泳，非对称PCR扩增ssDNA；链亲和素-Biotin分离纯化ss DNA；经过筛选使文库富集，采用未标记的引物对其进行PCR扩增后，连接至T载体，测序比对后得到特异性结合CEA的核酸适配体。

4.根据权利要求3所述的特异性结合CEA的核酸适配体筛选方法，其特征在于，原始随机ssDNA文库的序列为：5’-TGCGCTCTAGAGACGAAT-(N)45-CCTCAGCTGCAGGTATAC-3’。

5.根据权利要求3所述的特异性结合CEA的核酸适配体筛选方法，其特征在于，链亲和素-Biotin分离纯化ss DNA的步骤为：磁珠预处理；将非对称PCR产物至磁珠中，轻轻上下颠倒混匀，室温摇床孵育，磁力架上收集上清；用DNA抽提试剂抽提，吸出上清，剧烈混匀，离心取上清；上清用无水乙醇进行沉淀，离心后弃上清；乙醇清洗DNA，离心弃上清，再瞬离，吸干上清，再吹干；经过4轮阳性筛选后，加入反向筛选。

6.根据权利要求3所述的特异性结合CEA的核酸适配体筛选方法，其特征在于，ssDNA文库经过预处理，其步骤为：将ssDNA文库加TE溶解，浓度为100μM，取5nmol，95℃10min变性后迅速放冰中致冷至0℃，冰中放置10min以上。

7.根据权利要求1所述的特异性结合CEA的核酸适配体鉴定方法，其特征在于，将核酸适配体水浴活化后，将其加入高表达CEA的肿瘤细胞中，室温孵育，DAB显色试剂盒显色，在显微镜下观察细胞颜色。

8.一种检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有如权利要求1所述核酸适配体。

9.根据权利要求1所述的特异性结合CEA的核酸适配体在制备肿瘤检测试剂或肿瘤治疗药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为大肠癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、甲状腺髓样癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、泌尿系肿瘤或结肠癌。