[发明专利]一种筛选与目的化合物合成相关的基因的方法与应用

权利要求书

1.一种筛选与目的化合物合成相关的基因的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)选择目的化合物表达量有差异的不同样本，提取得到不同样本的总RNA；

(2)对步骤(1)得到的不同样本的总RNA分别进行三代全长转录组测序；

(3)对步骤(2)测序得到的原始数据进行分析，去冗余聚类，并用非全长序列对其进行校正，得到全长转录本；

(4)对步骤(1)得到的不同样本的总RNA分别进行二代测序，对下机数据进行数据质控；

(5)将步骤(3)得到的三代转录组的测序数据和步骤(4)得到的二代转录组的测序数据进行比对，以三代测序为参考，将二代的测序结果比对到三代，在二代数据中得到全长序列，降低二代测序中的拼接错误以及降低嵌合体的数量；同时根据二代的结果对三代测序中可能存在的碱基错误进行纠正，得到更为准确地测序结果；将三代测序得到的转录本作为参考，在不同的蛋白数据库进行比对，得到跟给定转录本具有最高序列相似性的蛋白，对步骤(3)得到的全长转录本进行基因功能注释和基因结构分析，得到目的化合物合成过程中的相关基因；

(6)用RSEM进行序列比对定量，统计每个样本中基因检测的情况；表达量以原始数据量和RPKM展示，对二代测序深度进行校正，再对基因或转录本的长度进行校正，获得基因的RPKM值后，再进行后续差异表达分析；

(7)利用软件DESeq2对基因表达水平分析中得到的数据量数据进一步分析，筛选FDR0.05且|log2FC|1的基因为显著差异基因，得到在合成目的化合物的过程中相对比较重要的基因。

2.根据权利要求1所述的筛选目的化合物合成相关的基因的方法，其特征在于还包括如下步骤：

(8)选择若干个差异表达基因进行荧光定量分析，证明步骤(7)分析得到的结果的可信度。

3.根据权利要求1或2所述的筛选目的化合物合成相关的基因的方法，其特征在于：步骤(1)和步骤(5)中所述的目的化合物为樟科阴香中萜类物化合物。

4.根据权利要求1或2所述的筛选目的化合物合成相关的基因的方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的样本通过如下方法确定：通过索氏提取的方法，在无水乙醇中提取不同阴香样本中的有机化合物，并通过气相质谱联用检测成分和含量，确定樟科阴香中萜类物化合物表达量有差异的不同样本；

步骤(1)中所述的总RNA是OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.8～2.0、OD₂₆₀/OD₂₃₀＝1.8～2.0的RNA。

5.根据权利要求1或2所述的筛选目的化合物合成相关的基因的方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的三代全长转录组测序的测序平台为Pacbio Sequel；

步骤(4)中所述的二代测序的平台为Illumina平台。

6.根据权利要求5所述的筛选目的化合物合成相关的基因的方法，其特征在于：

所述的三代全长转录组测序的步骤如下：

1)对总RNA进行逆转录，得到第一链cDNA；

2)对第一链cDNA进行PCR，扩增得到含双链cDNA的PCR产物；

3)对步骤2)得到的PCR产物进行纯化；

4)SMRTbell文库构建：包括DNA损伤修复、末端修复、连接适配体、文库质量评估；

5)将SMRTbell文库退火结合引物和聚合酶，采用MagBead Loading上机测序；

步骤(4)中所述的二代测序包括如下步骤：

A、从总RNA中分离得到具有polyA尾巴的真核mRNA；接着将真核mRNA片段化，以片段化的mRNA为模板，逆转录得到cDNA第一条链；随后用RNaseH降解RNA链，并在DNA polymeraseI体系下，以dNTPs为原料合成cDNA第二条链，接着纯化，得到纯化后的双链cDNA；

B、将步骤A最终得到的双链cDNA经过末端修复、加A尾并连接测序接头，筛选150-250bp的cDNA，进行PCR扩增，将得到的PCR产物纯化，获得文库；

C、将步骤B得到的文库进行二代测序。