[发明专利]一种可动态调控7-脱氧胆固醇及维生素D3的酿酒酵母菌的构建方法及应用

说明书

本发明涉及一种可动态调控7‑脱氧胆固醇及维生素D3的酿酒酵母菌的构建方法及应用，所述构建方法包括以下步骤：S1、使用启动子GAL7控制酿酒酵母工程菌种mot3基因的表达，转化入原始酵母菌中构建第一酿酒酵母菌；S2、构建麦角甾醇动态调控的dCas9系统并提取构建的质粒；S3、人工合成融合基因片段gal80F‑loxT‑P_TEF1‑DHCR24‑T_cyc1‑P_GAP‑DIC‑T_ADH1‑gal80R，将其转化进入第一酿酒酵母菌，PCR验证后获得第二酿酒酵母菌；S4、将步骤S3中构建的质粒转化进入第二酿酒酵母菌中，经筛选后获得可动态调控生产7‑DHC的酿酒酵母菌。本发明所提供的构建方法构建的酿酒酵母菌，通过在不影响菌株生长状态的同时，利用酿酒酵母内源的甾醇调控系统，结合dCas9系统实现副产物的减少，7‑DHC的产量提升。

技术领域

本发明涉及一种通过微生物动态调控7-脱氧胆固醇及维生素D3的酿酒酵母菌的构建方法及应用。

背景技术

维生素D是一种在人类生长发育维持生命过程中不可或缺的脂溶性维生素，不光在增殖和分化、钙稳态、骨骼新陈代谢中起重要作用，还可以改变神经传递和突触可塑性。胆钙化醇（Cholecalciferol, VD3）和麦角钙化醇（Ergocalciferol, VD2）是维生素D系列化合物的两个主要的存在形式。与VD2相比，VD3在提高和维持人体血清中25-羟基维生素D水平方面的效力高出87%。合成VD3的重要前提物质为7-脱氢胆固醇（7-DHC），它是一种高附加值的甾醇，7-DHC不光在医药和临床有重要应用，它也是制备胆甾相液晶材料的重要原料，在显示制造等方面也有广泛应用。工业中将获得的7-DHC，在波长230-300nm的紫外线照射下转化为VD3，因此，提高7-DHC的产量便相当于提高VD3的产量。

DHC和VD3的制造法目前主要集中在菌株的筛选和简单的分子改造方面，菌株筛选费时费力，需要花费大量金钱进行大规模的高通量筛选，才能获得7-DHC和VD3产量极低的菌株，获得菌株后往往还需要进行时间冗长的菌株鉴定过程，面临着基因改造方法的缺失等一系列问题。简单的分子改造主要集中于合成路径基因的强化，分支路径的基因敲除，但这样极易造成菌株代谢压力过高，有毒中间产物积累，不利于菌株的生长和生产。

如中国专利CN109154015A是通过敲除ERG5和ERG6基因，达到生产7-DHC的效果，但是敲除ERG5和ERG6会造成酿酒酵母合成麦角甾醇受阻。麦角甾醇是酿酒酵母细胞膜的重要组成成分，决定着膜的流动性和渗透性，阻断麦角甾醇的合成会导致细胞生长缓慢，胞内氧化还原失衡，代谢通量失衡等问题。

传统的7-DHC制备方法主要采用两种化学合成法，第一种是以胆固醇醋酸酯为原料，经过7-位的溴化，消除和水解反应合成7-DHC。第二种是以胆固醇醋酸酯为原料，经过氧化，腙化、消除和水解反应合成7-DHC。化学合成的方法虽然产量高，但是存在能耗高，反应条件苛刻且污染严重等问题，不利于可持续发展。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供一种动态调控酿酒酵母中7-DHC和VD3的生产产量的方法，在不影响菌株生长状态的同时，利用酿酒酵母内源的甾醇调控系统，结合dCas9系统实现副产物的减少，7-DHC的产量提升。

为了实现上述目的，设计一种可动态调控7-脱氧胆固醇及维生素D3的酿酒酵母菌的构建方法，包括以下步骤：

S1、使用启动子GAL7控制酿酒酵母工程菌种mot3基因的表达，转化入原始酵母菌中构建第一酿酒酵母菌；

S2、构建麦角甾醇动态调控的dCas9系统并提取构建的质粒；

S3、人工合成融合基因片段gal80F-loxT- P_TEF1-DHCR24- T_cyc1-P_GAP-DIC- T_ADH1-gal80R，将其转化进入第一酿酒酵母菌，PCR验证后获得第二酿酒酵母菌；