[发明专利]一种可动态调控7-脱氧胆固醇及维生素D3的酿酒酵母菌的构建方法及应用

权利要求书

1.一种可动态调控7-脱氧胆固醇及维生素D3的酿酒酵母菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、使用启动子GAL7控制酿酒酵母工程菌种mot3基因的表达，转化入原始酵母菌中构建第一酿酒酵母菌；

S2、构建麦角甾醇动态调控的dCas9系统并提取构建的质粒；

S3、人工合成融合基因片段gal80F-loxT- P_TEF1-DHCR24- T_cyc1-P_GAP-DIC- T_ADH1-gal80R，将其转化进入第一酿酒酵母菌，PCR验证后获得第二酿酒酵母菌；

S4、将步骤S2中构建的质粒转化进入第二酿酒酵母菌中，经筛选后获得可动态调控生产7-DHC的酿酒酵母菌。

2.如权利要求1所述的一种可动态调控7-脱氧胆固醇及维生素D3的酿酒酵母菌的构建方法，其特征在于，在所述步骤S1中，具体包括以下步骤：

S11、以酿酒酵母工程菌S228C基因组为模板，通过如SEQ ID 1和SEQ ID 2的引物获得基因片段Mot3，采用如SEQ ID 3和SEQ ID 4所示的引物扩增得到基因片段GAL7，采用如SEQID 5和SEQ ID 6所示的引物扩增得到上游同源臂基因片段NAT，以质粒pMHyLp-TRP1为模板，采用如SEQ ID 7和SEQ ID 8所示的引物扩增得到基因片段Loxp-Trp；

S12、将步骤S11中获得的4个基因片段转化进入感受态的原始酿酒酵母菌中并通过如SEQ ID 9和SEQ ID 10的引物验证培养后获得第一酿酒酵母菌。

3.如权利要求2所述的一种可动态调控7-脱氧胆固醇及维生素D3的酿酒酵母菌的构建方法，其特征在于，所述步骤S2中具体包括以下步骤：

S21、人工合成基因片段P_ERG3-dCas9- T_cyc1-P_SNR52-sgRNA- T_ADH1，使用如SEQ ID 11和SEQID 12的引物扩增得到基因片段Dcas9-sgRNA，以质粒PY13-TEF1质粒为模板，使用如SEQ ID13和SEQ ID 14的引物扩增得到部分质粒片段PY13-1；

S22、将步骤S21中获得的2个片段Dcas9-sgRNA和PY13-1使用无缝克隆酶进行无缝连接，并加入感受态的大肠杆菌中培养离心后，全部涂布在氨苄青霉素抗性的LB平板上，培养得到单菌落；

S23、将步骤S22中获得的单菌落，使用如SEQ ID 15和SEQ ID 16的引物进行菌落PCR验证并测序，将测序正确的单菌落接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，培养后进行质粒提取，得到质粒PY13-erg3-dCas9-sgRNA。