[发明专利]一种DNA 5mC或RNA m6A甲基化酶/去甲基化酶的酶活性检测方法

说明书

本发明涉及一种DNA 5mC或RNA m6A甲基化酶/去甲基化酶的酶活性检测方法。所述方法包括：在所述DNA 5mC甲基化酶/去甲基化酶或者RNA m6A甲基化酶/去甲基化酶的存在下，通过利用荧光偏振、时间分辨荧光能量共振转移(TR‑FRET)或均相光激发化学发光的信号来监测DNA甲基化结合蛋白或者RNA甲基化结合蛋白与带有荧光标记的底物结合状态随时间的变化，进而检测DNA 5mC甲基化酶/去甲基化酶或者RNA m6A甲基化酶/去甲基化酶的酶活性。所述方法具有高效快速、高灵敏度、所需样品少、低成本的特点。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种DNA 5mC甲基化酶/去甲基化酶或者RNA m6A甲基化酶/去甲基化酶的酶活性检测方法。

背景技术

DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰，通常发生于胞嘧啶的5号碳原子上，称为5mC修饰。5mC是一种重要的表观遗传标记，它参与基因转录调控，基因组印记，X染色体失活等许多生物学过程。在哺乳动物细胞内，5mC主要由DNMT家族蛋白以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体催化产生，其中DNMT1是维持甲基化酶，催化半甲基化的DNA形成双链全甲基化的DNA，DNMT3A/3B是从头甲基化酶，底物是无甲基化的DNA，参与形成初始的甲基化模式。5mC是一种稳定的化学标记，在细胞内可以通过一系列酶反应被逆转称为非修饰的胞嘧啶。这一过程主要由TET家族蛋白催化。TET家族蛋白是α-酮戊二酸(2-OG)和Fe²⁺依赖的双加氧酶，可以把DNA上的5-甲基胞嘧啶连续氧化成为5hmC、5fC和5caC。5hmC、5fC和5caC的氧化产物接着会通过碱基切除修复过程形成非修饰状态的胞嘧啶。

RNA上存在多种甲基化修饰，其中m⁶A是第一个被发现的发生在腺苷N6位上的可逆甲基化修饰，参与了众多RNA代谢过程，如RNA的转录后加工，RNA的降解，以及转录调控等过程。m⁶A主要由蛋白复合体METTL3-METTL14以SAM为甲基供体催化形成。m⁶A可以被逆转成为非修饰状态，催化这一过程的酶是FTO及ALKBH5，它们同样是2-OG和Fe²⁺依赖的双加氧酶。

大分子核酸上的甲基化修饰是重要的表观遗传标记，异常的甲基化与多种疾病密切相关。因此，靶向DNA/RNA甲基化修饰是目前国际上的研究热点。目前报道的DNA甲基转移酶抑制剂主要为核苷类似物。这类化合物的作用机制是被掺入基因组DNA的合成当中，因此具有较强的毒副作用。而非核苷类化合物往往具有活性差，选择性差，作用机制不明确等问题。DNA去甲基化酶，RNA甲基化酶，RNA去甲基化酶目前则少有抑制剂报道。因此，研究调控DNA/RNA相关甲基化修饰酶的小分子调控剂对生命科学以及临床医学具有重大意义。

目前筛选靶向核酸甲基化修饰酶的方法主要是一些非均相，低通量的方法(1)放射性同位素方法：通过³H标记的SAM作为底物，测试反应后被固定在固相载体上的核酸底物上的放射性来求出酶的反应活性。该方法是甲基转移酶测试的金标准方法，灵敏度高，准确，假阳性低。然而，该方法不能在普通实验室进行，且会造成放射性污染，除此之外，高昂的试剂和仪器的费用，以及复杂的实验操作限制了其在高通量筛选中的应用。(2)ELISA：ELISA也是测试核酸甲基化的经典方法，通过特定抗体将待检测的核酸固定在板上，然后利用抗体捕获的修饰底物的数量来确定酶的反应活性。(3)高效液相色谱方法：目前用来测试核酸去甲基化酶的经典方法，通过将反应产物酶切得到单个核苷酸，再通过高效液相色谱检测甲基化和非甲基化的碱基的含量。该方法假阳性低，但是由于样品处理步骤多，因此往往需要高浓度的底物和酶进行反应，由此该实验的灵敏度很低，成本也会较高，同时，仪器的限制使该方法耗时巨大。