[发明专利]一种靶向肿瘤的端粒酶检测系统、端粒酶检测方法及试剂盒

说明书

本发明具体涉及一种靶向肿瘤的端粒酶检测系统、端粒酶检测方法及试剂盒。肿瘤组织中端粒酶高表达因此有望作为肿瘤诊断标志物，然而机体中除肿瘤细胞外仍有部分正常细胞也具有端粒酶表达，可能会造成假阳性检测结果。本发明设计了一种靶向肿瘤细胞的端粒酶检测系统，所述检测系统以DNA四面体为载体，所述DNA四面体的顶点处具有DNA三链体和DNA双链体对接组件，其中DNA三链体作为肿瘤靶向识别元件，基于肿瘤组织外部pH响应进入肿瘤细胞释放DNA双链体，从而实现端粒酶检测元件的靶向释放，提高检测准确性。

技术领域

本发明属于端粒酶检测技术领域，具体涉及一种靶向肿瘤的端粒酶检测系统、应用所述检测系统的端粒酶检测方法、肿瘤诊断试剂盒及一种体外筛选抗肿瘤活性成分的方法。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

准确检测患病细胞中的生物标志物对于准确诊断和发病机理研究至关重要。然而，实际情况是，大多数生物标志物并非仅在异常细胞中表达。例如，端粒酶是一种核糖核蛋白，催化端粒酶重复序列(TAAGGG)n加到端粒末端，在多种恶性肿瘤细胞中过表达。它使肿瘤细胞能够避免端粒长度依赖性细胞凋亡并维持连续分裂，被认为是有前景的肿瘤生物标志物。实际上，除肿瘤细胞外，端粒酶活性还可以在其他非癌性细胞中检测到，例如种系细胞、循环干细胞和高度分裂的皮肤细胞。这些细胞中产生的信号可能会导致假阳性结果，降低评估结果的可信度。

为了降低上述检测过程中的假阳性结果，本领域常用的一种方法为引入其他类型的细胞内生物标记物(例如基因片段)以提高信号保真度，实现更准确的判断。然而，另一类型的生物标志物作为排他性指示剂也可能有其自身的局限性，并且势必将检测的步骤复杂化。

发明内容

本发明设计了一种从目标细胞中获取高保真信号的替代策略。关键设计是仅将识别元件传递给肿瘤细胞，而不是非癌细胞。对于肿瘤细胞，肿瘤微环境最独特的特征可能是酸性细胞外间质。肿瘤组织细胞的细胞外pH值约为6.4，而正常组织细胞的细胞外pH值约为7.4。相反，肿瘤细胞和正常细胞的细胞内pH值没有显示太大差异，并且两者都在7.4左右。基于该研究结果，本发明设计并优化了靶向肿瘤细胞的识别元件，将所述识别元件搭载于端粒酶检测系统，可以有效的解决上述假阳性检测问题。为了实现上述技术问题的选择，本发明提供以下技术方案：

本发明第一方面，提供一种靶向肿瘤的端粒酶检测系统，所述检测系统为DNA四面体，所述DNA四面体其中一对顶点具有DNA三链体，另一对顶点具有DNA双链体；

所述DNA三链体由发夹DNA链及端粒酶引物链组成；所述DNA双链体中荧光剂标记的长链(LD)及淬灭剂标记的短链(SD)部分杂交。

本发明所述端粒酶检测系统的工作原理如下：在DNA四面体纳米结构的顶点上设计两种类型的拉伸结构域，制备了DNA四面体对接组件(DTDA)。当遇到肿瘤细胞时，由于细胞外酸性pH值，DNA三链体为了保持其结构完整性会携带DNA四面体运送至肿瘤组织。DNA四面体载体可以很容易地通过依赖小窝蛋白的途径被细胞吸收，而无需转染剂，并且具有机械刚性，可以保持细胞内的长期稳定性，从而使DTDA内化到肿瘤细胞中。然后周围的pH从弱酸性变为弱碱性，胞嘧啶去质子化，导致端粒酶引物链(HTS)从DNA三链体上解离。分离的HTS就像在细胞质中漫游的释放物一样，通过端粒酶添加端粒重复序列而进一步延长。通过末端介导的链置换，延长的HTS可以置换SD并在延伸的顶点上与LD杂交，在分离后再次对接。荧光团不再被淬灭剂淬灭，并且可以观察到肿瘤细胞内部的荧光点亮。当遇到非癌细胞时，由于碱性细胞外pH值，HTS与DTDA分离。作为线性单链聚阴离子大分子，HTS无法直接穿透细胞膜进入细胞，从而终止细胞内对接事件。

本发明第二方面，提供一种端粒酶检测方法，所述检测方法采用第一方面所述靶向肿瘤的端粒酶检测系统实现。