[发明专利]一种pickering乳液及其制备方法和在制备疫苗免疫佐剂中的应用

说明书

本发明涉及免疫学技术领域，尤其涉及一种pickering乳液及其制备方法和作为疫苗免疫佐剂的应用。本发明制备的GO‑SQPickering乳液经稳定性测试和体外评估，显示出良好的稳定性和明显增强的佐剂效果；以CtpORF5重组蛋白疫苗为模式抗原，建立小鼠生殖道抗Ct感染模型，评估了GO‑SQPickering佐剂对机体的免疫保护力和安全性，结果显示，本发明提供的GO‑SQPickering乳液能够显著增强小鼠体液免疫及细胞免疫，且安全性较高。因此，具有增强免疫反应，提高疫苗免疫保护力的潜在价值。

技术领域

本发明涉及免疫学技术领域，尤其涉及一种pickering乳液及其制备方法和在制备疫苗免疫佐剂中的应用。

背景技术

传染性疾病一直是威胁人类健康最大的因素，尤其是新型病原体导致的疾病往往给全球卫生事业带来巨大挑战，给人类生产生活带来严重影响甚至是致命打击。历史上流感、鼠疫等造成的死伤数目触目惊心，本次新型冠状病毒肺炎的爆发再一次让人类惊醒。疫苗作为公认的预防传染性疾病最经济有效的手段再次成为大众焦点。佐剂可降低疫苗用量，增强免疫原性，在疫情爆发时有效应对疫苗产量及供应问题。目前已批准使用的佐剂主要包括铝盐类、乳剂类，Toll样受体激动剂类等。传统铝佐剂虽已广泛应用于多种疫苗，但其只能增强体液免疫不能增强细胞免疫且对亚单位疫苗作用有限，其它佐剂如脂质体、免疫调节物类、寡核苷酸类、多糖类、细胞因子类等目前均尚未实现临床应用，因此探索安全高效的新型佐剂仍是疫苗学研究的重点。

乳液(Emulsion)作为疫苗佐剂已有一定应用基础，目前有MF59、AS02、AS03、AF03等乳液类佐剂被批准用于人体，是除铝佐剂外应用最广泛的佐剂类型。乳液作为佐剂具有以下特征：(1)保护抗原口服乳液类佐剂能提高抗原在胃肠道中的稳定性，保护抗原免遭蛋白酶降解；鼻腔免疫时则能快速加强抗原迁移，避免长时间停留于鼻腔而被降解；(2)增加抗原表面积，调节免疫应答乳滴吸附抗原能增大抗原表面积，从而被抗原提呈细胞识别，并影响免疫反应强度和类型，因此液滴大小、组成成分、分散均匀度等均有可能是影响佐剂效果的因素；(3)缓释抗原纳米颗粒的吸附可促使抗原在注射部位缓慢释放，形成持续的免疫保护，申请者的最新研究发现，纳米乳佐剂以不同方式搭载抗原时，其抗原释放速度差异较大，进而导致佐剂效果大不相同，证明乳液的佐剂作用与抗原缓释密切相关；(4)物化性质优良乳液颗粒分布均匀，低温或常温均可保存；加之制备方法简单，成本较低，适合大规模生产，因而被认为是一种优良的疫苗佐剂。但仍存在以下几方面问题有待解决:

1.安全性有待进一步提高，传统乳液必须依靠表面活性剂稳定油水界面，用于佐剂注射至机体可能引发较强的副反应，因此需寻找适宜的替代物，尽量减少表面活性剂的使用量。2.稳定性有待进一步改善，乳液由于其热力学不稳定性，高温高压时易出现不同程度的破乳，从而影响颗粒完整性和佐剂效果，通常只能以过滤方式除菌。3.免疫增强机制未予阐明，目前研究认为乳液类佐剂通常与免疫细胞募集、抗原摄取有关，并倾向于Th1型免疫反应，与TLR无关，但深层次的免疫应答机制未知。4.具体的剂量、免疫程序和节省抗原的程度未明晰，难以衡量乳液佐剂对疫苗的辅助作用究竟到达何种程度，与目前已批准使用的佐剂对比是否效果更好。因此，提供一种既能避免使用表面活性剂又能稳定油水界面的乳液体系，并将其设计成新型的佐剂具有重要的现实意义。

Pickering乳液是指采用固体粒子稳定油水体系的一种特殊乳液。相较普通乳液，Pickering不需添加表面活性剂，且引入固体粒子的浓度大大低于表面活性剂的用量，对人体和环境的毒害作用远小于表面活性剂，故而安全性可能更高；另外，固体粒子在油水界面发生不可逆吸附，形成的界面膜牢固，可防止液滴聚并，因此Pickering乳液体系不易受外界酸碱性、盐浓度、温度及油相组成的影响，具有更强的稳定性。Xia等构建了基于PLGA粒子稳定的Pickering乳液，发现其佐剂效果明显优于以传统表面活性剂稳定的普通乳液佐剂，且优化的Pickering乳液可激活抗原呈递细胞并增强抗原募集，有效刺激体液和细胞免疫。