[发明专利]高通量全兔源单克隆抗体的制备方法

说明书

本发明涉及动物免疫，基因工程，抗体工程及自动化设备技术领域，尤其涉及高通量全兔源单克隆抗体的制备方法。提供的方案包括免疫、分选、扩增、重组、表达几个步骤，完全摒弃了利用传统杂交瘤技术和B细胞培养技术来获取兔单克隆抗体，无需进行细胞培养，通过直接克隆抗体VHVL，并构建至表达载体上实现兔单克隆抗体发现的技术，将兔单克隆抗体开发时间从8‑12周才能确定的完成整抗体序列，缩短至3周时间。并完全解决了杂交瘤技术和B细胞培养技术过程中，细胞凋亡和不稳定性等问题。

技术领域

本发明涉及动物免疫，基因工程，抗体工程及自动化设备技术领域，尤其涉及高通量全兔源单克隆抗体的制备方法。

背景技术

兔单克隆抗体是新一代单克隆抗体应用于科研、诊断和治疗。与小鼠单克隆抗体相比，兔单克隆抗体由于其独特免疫机制和抗体基因类型，具有更高亲和力，更强的特异性，广谱的抗原识别位点和易于人源化等特点，是近年来复合增长率最快的一物种抗体，已经迅速成为诊断和治疗各种传染性疾病，自身免疫病与肿瘤等人类疾病的重要工具。目前，越来越多的公司通过用高质量兔单克隆抗体来替换多抗或低亲合力鼠单克隆抗体产品，来改进难以复制的诊断和治疗产品。

目前兔单克隆抗体发现的主要技术方案包括：兔杂交瘤技术，噬菌体展示技术，兔B细胞培养技术。

兔杂交瘤技术芝是加哥Loyola大学的Katherine Knight教授在九十年代中期制备了第一株兔源的杂交瘤，可以分泌兔的单克隆抗体，然而第一代融合细胞株(240E-1)极不稳定且产量低。Robert Pytela和朱伟民等在Knight教授研究的基础上继续探索，最后非常幸运地获得了唯一的一株全新的融合细胞株，该融合细胞株可以用于产生稳定的兔源杂交瘤，稳定地分泌兔单克隆抗体。与著名学者余国良等共同创办Epitomics公司(专利创新技术：兔单抗开发平台拥有者)，并申请了专利进行全面的保护。但由于兔杂交瘤技术垄断地位和杂交瘤本身技术的壁垒，使其没有在市场中得到广泛的应用。

此后，人们分别通过噬菌体展示技术、兔B细胞培养技术制备兔单克隆抗体，但噬菌体展示技术获得的抗体效率低，且是随机配对的，未经过免疫监视/耐受选择的兔重组抗体，不是真正意义上的全兔源抗体，往往亲和力差。而兔B细胞培养技术虽然在筛选抗体特异性B淋巴细胞的阳性率从传统杂交瘤方法的不足5％提高至30％。但是该技术方案对B细胞的培养过程要求比较高，单个B淋巴细胞不易生存和繁殖，少量B细胞培养,会扩增出的几个重链和几个轻链基因，随机配对再验证抗体活性，增加了工作量。并且在培养的过程中会出现很多的细胞凋亡，丢失大量抗体基因。

可见，现有技术中尚无法实现兔单克隆抗体高通量、高品质的制备。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供高通量、高品质的全兔源单克隆抗体的制备方法。

本发明提供的高通量全兔源单克隆抗体的制备方法，包括：

步骤1：抗原免疫兔子后取外周血分离单个核细胞、脾细胞和肠系淋巴结细胞；

步骤2：流式细胞术分选抗原特异性B淋巴细胞；

步骤3：扩增所述抗原特异性B淋巴细胞的可变区和恒定区；

步骤4：所述可变区和恒定区经重组、表达获得兔源单克隆抗体。

本发明所述制备方法的步骤1中：所述免疫的抗原为蛋白、多肽、小分子化合物或核酸。本发明实施例中，所述抗原为Taq酶。

本发明中，所述兔子为雌性新西兰兔。一些实施例中，所述兔子为4～6月龄的雌性新西兰兔。

所述免疫的部位为颈部，四肢和/或背部。免疫的频率为每间隔两周免疫一次，共免疫6～9次。每次免疫的剂量为100～500μg。一些实施例中，每次免疫的剂量为100μg。

制备所述脾脏，肠系淋巴结和PBMC的细胞悬液后，进行流式分选。