[发明专利]高通量全兔源单克隆抗体的制备方法

权利要求书

1.高通量全兔源单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括：

步骤1：抗原免疫兔子后取外周血分离脾细胞；

步骤2：流式细胞术分选抗原特异性B淋巴细胞；

步骤3：扩增所述抗原特异性B淋巴细胞的可变区；

步骤4：所述可变区经重组、表达获得兔源单克隆抗体；

所述流式细胞术分选的标志物为：7AAD、CD4、CD8、CD11b、IgM、IgG和抗原;

步骤3中所述扩增包括反转录、第一轮巢式PCR扩增和第二轮巢式PCR扩增；

第一轮巢式PCR的正向引物在抗体基因的先导肽区域，反向引物位于IgG和IgM CH1区域与轻链Igκ和λ的CL区域；

所述第二轮巢式PCR获得重链可变区扩增产物、轻链λ可变区扩增产物和轻链κ可变区扩增产物；

所述第一轮巢式PCR扩增的引物包括：

1st-rVH-F ATGGAGACTGGGCTGCGCTGG；

1st-rVH-R(IgG) TCACCGTGGAGCTGGGTGTG；

1st-rVK-F ATGGACACVAGGGCCCCCAC；

1st-rVλ-F GCCTGGRCYCCDCTSCTCCT；

1st-rVK-R TGGGAAGAKGAGGACAGWAG和

1st-rVλ-R CTTGAGYTCCTCWGAGGAGG；

所述第二轮巢式PCR扩增的引物包括：

重链可变区引物：

2nd-rVH-F1 CAGGAGCAGCWGAAGGAATC；

2nd-rVH-F2 CAGGAGCAGCTGAWGGAGTC；

2nd-rVH-F3 CAGCAGCAGCTGGAGGAGTC；

2nd-rVH-F4 CAGGAGCAGCAGAAGGAGTC；

2nd-rVH-F5 CAGRAGCAGCTGGTGGAGTC；

2nd-rVH-F16 CAGTCGCTGGAGGARTCC；

2nd-rVH-F7 CAGTCGKTGGAGGAGTCC；

2nd-rVH-F8 CAGWCAGTGAAGGAGTCC；

2nd-rVH-F9 CAGTCGCTGGRGGAGTCC；

2nd-rVH-F10 CAGTCGGTGGAGGAGTCC；

2nd-rVH-R1 TGAAGAGATGGTGACCRGG；

2nd-rVH-R2 TGAGGAGACGGTGACCAGG；

2nd-rVH-R3 TGAAGAGACGGTGCAGAGG和

2nd-rVH-R4 TGAAGAGACGGTGACSASG；

轻链κ可变区引物：

2nd-rVK-F1 GCYCAAGTGCTGACCCAG；

2nd-rVK-F2 GCCCWAGTGATGACCCAG；

2nd-rVK-F3 GCSCTTGTGATGACCCAG；

2nd-rVK-F4 GCCCAAGGGCCAACCCAG；

2nd-rVK-F5 GCCATCGATATGACCCAG；

2nd-rVK-F6 GCCGTCGTGCTGACCCAG；

2nd-rVK-F7 GCCATCAAAATGACCCAG；

2nd-rVK-F8 GACCCTGTGATGACCCAG；

2nd-rVK-R1 TTTGATTTCCACMTTGGTG；

2nd-rVK-R2 TTTGATTTCCAGYTTGGTC；

2nd-rVK-R3 TTTGACSACCACCTCGGTC和

2nd-rVK-R4 TTTGATCTCCACCWTGGTC；

轻链λ可变区引物：

2nd-rVλ-F1 AGCGTTGTGTTCACGCAG；

2nd-rVλ-F2 CAGCCTGCCCTCACTCAG；

2nd-rVλ-F3 CAGCCTGTGCTGRCTCAG；

2nd-rVλ-F4 GAGGCTGCMCTGACTCAG；

2nd-rVλ-F5 CAGTTTGTGCTGACWCAG；

2nd-rVλ-F6 CAGGCACAGCTGAATCAAC；

2nd-rVλ-F7 CAGTTTGTGCTGAATCAAC；

2nd-rVλ-F8 CAGAGGGGAAGGAAGGCG；

2nd-rVλ-F9 CAGAGCAGGGGTTTCCATC；

2nd-rVλ-F10 TCCTATGAGCTSACACAG；

2nd-rVλ-R1 TGTGACAATGACCTTGGTC和

2nd-rVλ-R2 TGTGACGGTCAGCTGGGTC。