[发明专利]一种基于可控相分离液滴对细胞内源基因转录过程的高效控制方法

说明书

本发明公开了一种基于可控相分离液滴对细胞内源基因转录过程的高效控制方法，利用相分离技术原理设计模块化组合的转录因子，根据所靶基因序列的特征，通过CRISPR/dCas9技术使转录因子结合在靶基因启动子区域，借助模块化组合的转录因子中的IDR相分离过程形成凝聚体液滴，增强调节转录因子与转录复合物间的相互作用。通过筛选比较不同的IDR来优化凝聚体的状态，实现对活细胞内源基因转录的高效精准控制。本发明方法将在内源基因表达调控、诱导多能干细胞发育以及全基因组测序等方面有重要应用。

技术领域

本发明涉及一种新的对活细胞内源基因转录过程的精准高效调控方法，属于分子生物学和细胞生物学领域。

背景技术

在生物体的发育过程中，特定的基因在不同的细胞中表达、行使不同的功能以建立不同类型的细胞。这需要对基因表达进行复杂的调控，而基因表达的调控在很大程度上依赖于基因转录成mRNA的过程。哺乳动物细胞的转录调控是迄今发现的最复杂的调控系统之一，对基因的选择性表达和细胞分化等过程起到主要控制作用。在过去的几十年中，生物学家从分子和细胞生物学领域研究阐明了转录过程以及参与转录过程的一些转录复合物，并阐明了有关如何调控这些转录复合物进而调控转录的机制。转录调控过程包括转录起始控制、转录延伸控制、转录终止控制等。转录调控极为复杂，涉及上百种蛋白参与协同控制。在这些转录调控复合物中，转录因子在转录起始中调控基因的特异性表达。转录因子能够结合在特定基因上游启动子区域，并招募RNA聚合酶等一系列转录调控复合物，驱动转录进程。因此，转录因子在转录、细胞周期、响应细胞间信号传递、对环境压力的响应以及发育等方面都有着重要的调控作用。在细胞的重编程中，需要特异性的启动某些基因的表达。当我们人为干预基因的表达过程，就能够逆转细胞命运，控制细胞的生命活动过程。对于内源基因的表达过程进行操纵，需要利用特异性增强或抑制某些基因的表达。基于此，目前亟需开发一种能实现在活细胞内基于转录因子实现对内源基因转录过程的精准高效调控的方法。现在使用最为广泛的是利用CRISPR/dCas9系统对基因的表达过程进行干预，使用内切酶结构域失活的dCas9融合上转录抑制蛋白(KRAB等)或者转录激活蛋白(VP16或VPR等)，利用特异性的sgRNA导向，将dCas9-效应蛋白导向到特异的基因位置，实现基因特异性的表达调控。这些技术操作简易，起效迅速，被统称为CRISPRa或CRISPRi。但是现有的转录激活蛋白或者抑制蛋白的激活或抑制效应不高，对某些基因的转录激活和抑制作用不明显，限制了其在细胞生物学中的广泛的应用。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种控制细胞内源基因转录过程的一种重要工具，以克服现在对于细胞内基因转录调控效率低的问题。本发明综合利用分子生物学和细胞内生物学相变的方法，可以在活细胞中高效控制任意基因的转录过程，进而研究该基因表达改变对细胞生命活动的影响。

转录因子是一类高度模块化的蛋白，各功能区域的排列顺序和数目取决于转录因子本身。而在这些功能区域中，最重要的就是DNA结合域(DNA binding domain,DBD)和转录激活结构域(Transactivation domain,TAD)。DNA结合域具有有序的结构，是与靶基因上游启动子或增强子序列结合的区域，是转录因子中最重要的领域。转录激活结构域通常都包含天然的无序结构(Intrinsically Disordered Region,IDR)，是和其他转录复合物(比如RNA聚合酶，转录调节因子等)结合的区域，是确保转录完成的重要结构域。