[发明专利]一种表面展示RGNNV MCP蛋白的重组芽孢及其制备方法与应用

说明书

本发明提供了一种表面展示RGNNV MCP蛋白的重组芽孢及其制备方法与应用，属于生物技术基因工程技术领域；在本发明中，以野生型枯草芽孢杆菌WB600菌株为载体，通过芽孢表面展示技术将RGNNV病毒的RNA2编码衣壳蛋白（MCP）展示于枯草芽孢杆菌表面，进而得到重组芽孢；所述重组芽孢可作为口服疫苗添加到稚鱼饵料中，克服现有口服疫苗容易被降解灭活、无法添加到稚鱼饵料中去的弊端，同时避免注射免疫方案中捕捞鱼和注射对鱼体的损伤，且将NNV的优良免疫原展示在芽孢表面，定植肠道进行抗原呈递，能有效的刺激鱼类的先天性及后天性免疫系统，达到防治NNV的目的。

技术领域

本发明属于生物技术基因工程技术领域，具体涉及一种表面展示RGNNV MCP蛋白的重组芽孢及其制备方法与应用。

背景技术

鱼类病毒性神经坏死症(viral nervous necrosis, VNN)危害鱼类种类多，流行范围广，发病季节长，尤其对幼稚鱼最为严重，死亡率高达100％，给水产养殖带来严重危害和巨大经济损失。鱼类病毒性神经坏死症是由神经坏死病毒(nervous necrosis virus，NNV)引起的，是一种以患病幼稚鱼食欲差，体色灰白或偏黑，常浮在水面，间或螺旋游动，组织切片可见脑部坏死性病变和对幼稚鱼高致死率为主要特征的严重危害鱼类养殖的病毒性传染病。

NNV隶属β-野田病毒属( Betanodavirus)，是β-野田病毒属中致病力最强的毒株。NNV有4种基因型(RGNNV、BFNNV、SJNNV、TPNNV)，其中RGNNV为目前主要流行株。RGNNV病毒基因组由 RNA1和RNA2组成，RNA1编码RNA聚合酶，RNA2编码衣壳蛋白（MCP）。MCP蛋白为NNV病毒唯一的结构蛋白，也是主要病毒抗原，其在病毒侵袭和复制中发挥重要作用，表达提纯的衣壳蛋白在电镜下可以观察到病毒样颗粒，具有很好的免疫源性。

目前，已经开发数种神经坏死病毒（NNV）疫苗，包括灭活病毒疫苗、类病毒颗粒疫苗和重组亚单位疫苗，能够在一定程度上控制鱼类神经坏死病。但是，灭活病毒疫苗和类病毒颗粒疫苗免疫期短，常需强化接种，成本高，存在毒力返祖的安全性隐患，可能对动物和环境产生有害影响；重组亚单位疫苗，如蛋白疫苗和核酸疫苗，安全性比较高，有很大的应用潜力，但是重组亚单位疫苗的稳定性差，容易降解，且只能通过注射免疫。然而，NNV病毒的主要侵染对象为仔鱼、稚鱼，体型较小无法通过注射疫苗的形式进行免疫，急需可以口服免疫仔稚鱼的疫苗，但口服疫苗在生产、加工、储存和运输过程中，核酸或蛋白抗原容易降解。

发明内容

针对现有技术中存在的一些不足，本发明提供了一种表面展示RGNNV MCP蛋白的重组芽孢及其制备方法与应用。在本发明中，以野生型枯草芽孢杆菌WB600菌株为载体，通过芽孢表面展示技术将RGNNV病毒的RNA2编码衣壳蛋白（MCP）展示于枯草芽孢杆菌表面，得到了重组芽孢，所述重组芽孢可作为口服疫苗添加到稚鱼饵料中，克服现有口服疫苗容易被降解灭活、无法添加到稚鱼饵料中去的弊端，同时避免注射免疫方案中捕捞鱼和注射对鱼体的损伤，且将NNV的优良免疫原展示在芽孢表面，定植肠道进行抗原呈递，能有效的刺激鱼类的先天性及后天性免疫系统，达到防治NNV的目的。

本发明中首先提供了一种表面展示RGNNV MCP蛋白的重组芽孢，所述重组芽孢以枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因CotC为分子载体，与赤点石斑鱼神经坏死病毒RGNNV蛋白基因MCP重组，构建融合表达的整合型质粒并转化枯草芽孢杆菌得到枯草芽孢杆菌重组菌株，诱导重组菌株产生表面展示RGNNV MCP蛋白的重组芽孢，记为B.S-CotC-MCP。

其中，所述枯草芽孢杆菌为WB600菌株  Bacillus subtilis WB600，ATCC bio-82278。