[发明专利]一种重组的非洲猪瘟病毒p72亚单位蛋白和制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种重组的非洲猪瘟病毒p72亚单位蛋白及其制备方法及其应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述制备方法如下：1)将密码子优化后的非洲猪瘟病毒pB602L蛋白编码基因序列克隆到原核表达载体中，得到含有非洲猪瘟病毒pB602L亚单位蛋白编码基因的重组质粒；2)再将所述含有非洲猪瘟病毒pB602L亚单位蛋白编码基因的质粒重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞中，得到重组工程菌；3)中重组工程菌进行诱导表达，并从菌体裂解上清中纯化非洲猪瘟pB602L亚单位结构蛋白。本发明能够提供一种可大规模工业化生产的非洲猪瘟结构蛋白pB602L亚单位蛋白且制备方法简单、成本低能够达到国家现有标准。

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域。涉及一种非洲猪瘟p72蛋白大规模制备方法和应用。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是可引起的猪的急性、热性、高度接触性传染病，发病率及死亡率高达100％。家猪和野猪是ASFV自然感染的唯一哺乳动物宿主，对畜牧业影响巨大。该病最早在1921年于非洲的肯尼亚国家确认发生，对非洲乃至全球多个国家的养猪业造成极大损失。2018年8月份以来，在我国多个省份爆发，给我国养猪业造成毁灭性打击。该病是世界动物卫生组织A类疫病，在我国被列为一类动物传染病。

国内外学者对非洲猪瘟做了大量的研究工作，但研究发现：常规制备的非洲猪瘟灭活苗效果不明显，而自然弱毒苗或重组弱毒苗保护效果好，但安全性差，易造成散毒。目前，世界上尚未有有效预防非洲猪瘟的疫苗和治疗该病的药物发现，迫切需要新型疫苗的研发和生产来预防非洲猪瘟。

非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)是具有囊膜的DNA病毒。病毒粒子平均直径200nm，呈二十面体对称结构，表面有含糖脂类的囊膜覆盖。其病毒基因组为双股线性DNA，大小为170-190kb，整个基因组大约有150个ORF，编码150-200中蛋白质。由外至内分五层结构：分别为外层囊膜结构、外层衣壳蛋白、内层囊膜结构、内层衣壳蛋白，病毒核酸。P72蛋白是非洲猪瘟表面外层衣壳最主要结构蛋白。其蛋白含量约占病毒粒子蛋白量的32％。该蛋白由ASFV病毒B646L基因编码的，分子量大小约32kD的蛋白。研究发现，p72蛋白相对比较保守，有稳定的抗原性。且与病毒进入宿主细胞的过程有关，针对p72的抗体能够抑制病毒与巨噬细胞的结合。因此，p72是一个很好的保护性抗原。目前，已经有P72蛋白能成功的表达在原核系统，但表达产量低，且以包涵体形式存在，(具体参见公开号为CN103805615的发明专利)结构折叠不正确，无法满足基因工程亚单位疫苗的开发。pB602L蛋白由B602L基因编码的病毒非结构蛋白。目前的研究发现，该蛋白是病毒复制晚期的一种非结构蛋白，其作为分子伴侣，促进衣壳蛋白p72蛋白的正确折叠，若缺少pB602L蛋白，会导致衣壳蛋白p72不能正确折叠，导致病毒装配过程发生改变不能形成二十面体，最终病毒不能正确组装成病毒颗粒。因此，pB602L对p72蛋白的正确折叠非常关键，因此要想成功大量表达p72蛋白必须同时表达pB602L。Liu等利用HEK293同时表达p72和B602L得到了三聚体p72蛋白，首次展示了p72的结构(Structure of the African swine fever virus majorcapsid protein p72，2019)，但该方法在HEK293中尚不能大量生产，对于后续的开发仍然是个挑战。专利CN111363016A，文章(Expression and purification of p72 trimers assubunit vaccine candidate，2020)等公开了一种在酵母中生产重组P72的方法，虽然酵母操作相对于真核细胞发酵周期短，成本较低，但该方法生产的p72蛋白产量不高50mg/L,且p72不纯无法去除B602L。不利于后续亚单位疫苗评价。

发明内容