[发明专利]一种重组的非洲猪瘟病毒p72亚单位蛋白和制备方法及其应用

权利要求书

1.一种重组的非洲猪瘟病毒p72亚单位蛋白，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒p72亚单位蛋白主要为三聚体结构的p72亚单位蛋白，其中，所述三聚体结构的p72亚单位蛋白为非洲猪瘟病毒结构蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述三聚体结构的p72亚单位蛋白占总p72亚单位蛋白量不低于75％。

2.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒p72亚单位蛋白，其特征在于，在如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端连接有poly-His、FLAG、c-myc、Strep-tagⅡ中的一种标签。

3.根据权利要求1-2任一所述的非洲猪瘟病毒p72亚单位蛋白，其特征在于，所述三聚体结构的p72亚单位蛋白占总p72亚单位蛋白含量不低于80％。

4.根据权利要求1-2任一所述的非洲猪瘟病毒p72亚单位蛋白，其特征在于，所述三聚体结构的p72亚单位蛋白占总p72亚单位蛋白量不低于85％。

5.根据权利要求1-2任一所述的非洲猪瘟病毒p72亚单位蛋白，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒p72亚单位蛋白占总蛋白含量不低于80％，且pB602L亚单位蛋白不高于5％。

6.一种如权利要求1-5任一所述的重组的非洲猪瘟病毒p72亚单位蛋白的制备方法，其特征在于，所述大规模制备方法包括如下步骤：

1)重组杆状病毒的制备：为将密码子优化后的非洲猪瘟病毒p72蛋白和密码子优化后的pB602L蛋白表达基因经克隆、转化、感染sf9细胞和/或HighFive5细胞，以得到含有非洲猪瘟病毒p72亚单位蛋白表达基因的重组杆状病毒；

2)发酵培养：再将所述重组杆状病毒进行扩大培养后进行发酵，收集培养液；

3)亚单位蛋白纯化：发酵培养步骤2)中所述培养液进行纯化，纯化后得到重组的非洲猪瘟病毒p72亚单位可溶性蛋白。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在步骤1)中，所述将密码子优化后的非洲猪瘟病毒p72蛋白和密码子优化后的pB602L蛋白表达基因经克隆、转化、感染sf9细胞和/或HighFive5细胞为将密码子优化后的非洲猪瘟病毒p72蛋白和密码子优化后的pB602L蛋白表达基因同时克隆到pFastBac1转移载体，经克隆、转化、感染sf9细胞和/或HighFive5细胞，再经发酵培养及纯化，以得到含有非洲猪瘟病毒p72亚单位蛋白表达基因的重组杆状病毒rBac-p72-pB602L。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在步骤1)中，所述将密码子优化后的非洲猪瘟病毒p72蛋白和密码子优化后的pB602L蛋白表达基因经克隆、转化、感染sf9细胞和/或High Five5细胞为将密码子优化后的非洲猪瘟病毒p72蛋白和密码子优化后的pB602L分别克隆到pFastBac1转移载体，经克隆、转化、感染sf9细胞，以得到含有非洲猪瘟病毒p72亚单位蛋白表达基因的重组杆状病毒rBac-p72和含有非洲猪瘟病毒pB602L亚单位蛋白表达基因的重组杆状病毒rBac-pB602L。

9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在步骤2)中，将所述重组杆状病毒进行扩大培养的方法包括：

将所述重组杆状病毒转染sf9细胞，培养72h，得到P1代重组杆状病毒；

将所述第一代重组杆状病毒转染sf9细胞，培养72h，得到P2代重组杆状病毒；

重复转染sf9细胞的步骤，获得Pn代重组杆状病毒；

其中所述n为自然数；

步骤2)中所述发酵培养的细胞为sf9细胞和/或HighFive5细胞，细胞密度为1×106-2.5×106/ml,感染用的病毒为rBac-p72-pB602L，按照感染复数(MOI)为0.2-2的接种量接种到sf9或HighFive上；或rBac-p72和rBac-pB602L，按照感染复数(MOI)为0.1-1的接种量同时接种到sf9或HighFive上。

10.一种根据权利要求1-5任一所述的非洲猪瘟病毒p72亚单位蛋白在制备非洲猪瘟p72蛋白或非洲猪瘟p72亚单位疫苗的诊断试剂中的应用。