[发明专利]一种具有群体淬灭活性的枯草芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法、应用

说明书

本发明涉及生物技术和基因工程技术领域，尤其涉及一种具有群体淬灭活性的枯草芽孢杆菌基因工程菌及其应用，所述构建方法为将酰基高丝氨酸内酯酶编码基因克隆到枯草芽孢杆菌表达载体上，去掉载体上调控蛋白编码基因lacI，再转入枯草芽孢杆菌，得到具有群体淬灭活性的枯草芽孢杆菌基因工程菌。本发明所构建的表达AHL内酯酶的重组枯草芽孢杆菌，不需要额外添加诱导剂就能持续性表达高活性的群体感应淬灭酶AhlX，所用的宿主为环境友好型的枯草芽孢杆菌，在防治植物细菌性病害方面有着天然的优势，与化学农药相比无污染，无毒害，无残留，对环境无伤害，是一个绿色防控措施，在防治细菌性病害方面具有很大的潜力。

技术领域

本发明涉及生物技术和基因工程技术领域，尤其涉及一种具有群体淬灭活性的枯草芽孢杆菌基因工程菌及其应用。

背景技术

植物软腐病是由胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)引起的植物病害，欧文氏菌能够侵染植物组织或器官，使植物出现大面积的腐烂，对农业生产造成了巨大危害。目前对植物软腐病的防治方法有合理轮作、避免机械损伤、喷洒农药或植物水提液等，这些方法不仅增加了人力消耗，还会造成环境污染、危害人体健康。因此，新型环境友好型的病害防治策略亟需研究和开发。

群体感应(Quorum Sensing，QS)是指细菌通过感知自身所分泌的化学信号分子浓度，调控特定基因的表达，并协调细菌的一系列生物学行为的现象。在致病菌欧文氏菌(E.carotovora)中，同样存在这种群体感应现象，欧文氏菌通过分泌酰基高丝氨酸内酯类信号分子(AHLs)，调控一些致病因子的表达，从而引起植物软腐病的发生。

群体淬灭(Quorum Quenching，QQ)通过抑制或干扰生物细胞间QS系统，阻断细胞间的“信息交流”，从而防御致病菌感染，因此被视为一种绿色环保型病害防治策略。其作为一种新型环境友好型的病害防治策略，能够有效抑制病原菌的致病性，并且不会引起细菌抗药性。

AhlX是一种金属-β-内酰胺类酰基高丝氨酸内酯酶，它能够水解AHLs信号分子的内酯环，从而起到降解信号分子的作用，其拥有独特的耐盐能力、热稳定性。

枯草芽孢杆菌B.subtilis 168是一种优良的生防菌，在环境中广泛存在，对人畜无害，在食品、饲料和农业方面应用广泛。目前，枯草芽孢杆菌本身作为一种生防菌已应用于植物病害的生物防治。

将AHL内酯酶表达在枯草芽孢杆菌B.subtilis 168中，可以集中二者的优势，有望代替化学农药，有效抑制植物软腐病的发生，符合“健康、绿色”的生活理念。

发明内容

本发明为了克服上述现有技术中存在的技术问题，提供了一种具有群体淬灭活性的枯草芽孢杆菌基因工程菌的构建方法。

本发明还提供了一种由上述构建方法得到的具有群体淬灭活性的枯草芽孢杆菌基因工程菌。

本发明还提供了一种具有群体淬灭活性的枯草芽孢杆菌基因工程菌在制备防治胡萝卜软腐欧文氏菌所导致的植物软腐病药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种具有群体淬灭活性的枯草芽孢杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，将酰基高丝氨酸内酯酶编码基因(ahlX基因)克隆到枯草芽孢杆菌表达载体上，并转入枯草芽孢杆菌，得到具有群体淬灭活性的枯草芽孢杆菌基因工程菌。

作为优选，所述表达载体以pHT01基础，去除其表达调控蛋白的编码基因lacI，使其能够在不添加诱导剂的条件下，在枯草芽孢杆菌中高效表达。

作为优选，所述酰基高丝氨酸内酯酶能够有效水解酰基高丝氨酸内酯类信号分子。

作为优选，所述表达载体的构建包括下步骤：