[发明专利]一种使用酶切探针报告系统的检测腺病毒HAdV的引物探针组合物及其试剂盒

说明书

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种用于检测腺病毒的引物探针组合产品。所述引物探针组合产品包含F3和B3组成的外引物对和FIP和BIP组成的内引物对，以及环引物和探针。本发明提供的试剂盒用于腺病毒DNA检测，具有操作简单、快速、灵敏的特点，为腺病毒的现场快速检测筛查提供有效的技术手段，具有重要意义。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种检测腺病毒HAdV的引物探针组合物及其试剂盒。

背景技术

人腺病毒（Human adenovirus, HAdV）肺炎（以下简称腺病毒肺炎）是儿童社区获得性肺炎中较为严重的类型之一，多发于6个月至5岁儿童，是目前造成婴幼儿肺炎死亡和致残的重要原因之一。

HAdV属于哺乳动物腺病毒属，为无包膜的双链DNA病毒，1953年由Rowe等首次发现。目前已发现至少90个基因型，分为A-G共7个亚属，不同型别 HAdV的组织嗜性、致病力、流行地区等特性不同。HAdV感染可引起多种疾病，包括肺炎、支气管炎、膀胱炎、眼结膜炎、胃肠道疾病及脑炎等。与呼吸道感染相关的HAdV主要有B亚属（HAdV-3、7、11、14、16、21、50、55 型），C 亚属（HAdV-1、2、5、6、57型）和E亚属（HAdV-4型）。

在儿童腺病毒肺炎诊疗规范中，对腺病毒的病原学检查包括以下几种：（1）病毒分离和血清学鉴定。传统的病毒分离和血清分型方法虽是诊断腺病毒的金标准，但不适于临床早期诊断。（2）抗原检测。针对腺病毒衣壳六邻体抗原进行检测，多采用免疫荧光方法，标本为鼻咽抽吸物、鼻咽拭子、痰液及肺泡灌洗液，发病 3-5 天内检出率最高，重症病例 2-3周仍可阳性。但是该方法存在特异性不高的情况。（3）PCR检测。比传统的病毒培养和病毒抗原检测敏感性更高，标本为鼻咽拭子或痰液、支气管肺泡灌洗液等。实时定量 PCR 可对病毒进行定量分析，帮助预测病情严重程度。但是但是该法需要依赖于较为复杂的检测流程和相对复杂高价的仪器，同时对于检测环境的要求很高，目前需要在疾控中心等地集中检测，容易面临检测试剂有限、检测仪器和实验人员均超负荷运转等问题，无法广泛普及至广大基层医院、防控现场和家庭。（4）其他方法。宏基因测序在诊断腺病毒感染以及分型方具有优势，但价格昂贵，结果需要专业人员判定，不推荐常规开展。该方法主要用于特殊人群如合并基础疾病、免疫缺陷病、其他方法检测阴性或病情危重以及混合感染需尽早明确病原的患儿，结果判断必须结合临床。

随着体外核酸恒温扩增的悄然兴起，传统扩增技术的局限性有所改变，在过去的十年中，使核酸体外扩增变得更加简单和方便的一些等温核酸扩增技术已得到快速发展，如LAMP（环介导核酸扩增技术）、HDA（解旋酶依赖等温核酸扩增技术）、RPA（重组酶依赖的扩增技术）等均可在等温条件下扩增病毒核酸。这些技术只需要温度控制装置来保持一个恒定反应温度，就可以实现高效的核酸扩增，从而得以摆脱对精密控制温度变化的PCR仪的依赖。若能在无需反复变温的反应条件下实现核酸的扩增，将进一步使核酸扩增技术简单化，并有利于此类技术更广范围的应用。及时准确地病毒检测对于疾病的防治具有重要意义，因此研究和开发一种能在基层诊疗机构使用，在常温下快速检测核酸的试剂盒非常有必要。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一方面涉及引物探针组合物，其包含F3和B3组成的外引物对和FIP和BIP组成的内引物对，以及环引物和探针；

F3、B3、FIP、BIP的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1~4所示；

HAdV-F3（SEQ ID NO .1）：5’-TTGCGATCGCACCCTTTG-3′

HAdV-B3（SEQ ID NO .2）：5’-ACACGGACCACGTCAAAG-3′