[发明专利]一种精浆谷胱甘肽过氧化物酶活性的定量测定方法及试剂盒

说明书

本发明公开了一种精浆谷胱甘肽过氧化物酶活性的定量测定方法及试剂盒，包括：取精液标本，离心，取上清液于离心管中，得到精浆标本，向精浆标本中加入试剂1以及试剂2，混匀，测定吸光度值A_测定1，其中，试剂1为包括还原型谷胱甘肽、EDTA‑Na₂以及叠氮钠的磷酸盐缓冲液，试剂2为包括谷胱甘肽还原酶以及NADPH的磷酸盐缓冲液；向所述精浆标本中加入试剂3，混匀，反应，测定吸光度值A_测定2，其中试剂3为包括异丙苯过氧化氢的磷酸盐缓冲液；同样步骤得到空白对照组，测定吸光度值A_空白1，再加入试剂3，混匀，反应，测定吸光度值A_空白2；将测定值通过以下公式进行计算：GSH‑Px活性(nmol/min/mL)＝[(△A测定‑△A空白)÷ε÷d×V_总×10⁶]÷V_样÷T。

技术领域

本发明属于精子生化指标体外检测的技术领域，涉及一种精浆谷胱甘肽过氧化物酶活性的定量测定方法及试剂盒。

背景技术

大量已发表的证据表明氧化应激在精子功能损害中起作用，活性氧增多常导致精子活力降低、精子DNA完整性受损、顶体反应及精子与卵子融合能力减低。精浆和精子中存在的谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase，GSH-Px)是一种抗氧化物质，能够特异地催化还原型谷胱甘肽与活性氧反应，生成氧化型谷胱甘肽，从而保护精子免受活性氧损害，维持其正常功能。精子中的GSH-Px主要位于细胞质中，但由于精子含有的细胞质较少，机体主要依靠精浆中GSH-Px发挥抗氧化作用。精浆中GSH-Px活性降低表明精子抗氧化能力减弱，可导致精子质膜的脂质过氧化损伤发生，是引起男性不育的重要病理因素之一。

目前，实验室GSH-Px活性主要采用两种方法，一是采用苯甲酸底物法进行GSH-Px活性检测，该方法利用GSH-Px可催化谷胱甘肽(GSH)与苯甲酸发生氧化反应，生成黄色阴离子，该物质在422nm处有吸收峰，吸光度值与GSH减少的量成正比，从而间接推算GSH-Px活性。该方法操作简单，但检测结果精密度差。二是采用紫外分光光度法检测GSH-Px活性，该方法利用过氧化氢(H₂O₂)或叔丁基化过氧氢在GSH-Px催化下与GSH反应生成氧化型谷胱甘肽(GSSG)，GSSG在谷胱甘肽还原酶(GRD)催化下被NADPH还原为GSH，同时NADPH被氧化生成NADP+，NADPH在340nm有吸收峰，吸光度变化值与GSH-Px活性成反比。因此，通过测定340nm吸光度减少速率可计算出GSH-Px活性。但H₂O₂或叔丁基化过氧氢在水溶液中易挥发，稳定性差，且叔丁基化过氧氢为易燃、易爆品，安全隐患大。另外，该方法检测结果虽然比终点法准确度有所提高，但一些生殖道感染患者精液标本中内源性过氧化物酶可与H₂O₂或叔丁基化过氧氢反应，使检测结果假性减低，不能满足临床诊疗需求。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种精浆谷胱甘肽过氧化物酶活性的定量测定方法，通过采用异丙苯过氧化氢作为氧化剂，叠氮钠抑制内源性过氧化物酶，使得本方法准确度高、精密度好、安全性高、操作简单、可自动化、易于临床推广。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种精浆谷胱甘肽过氧化物酶活性的定量测定方法，包括步骤如下：

步骤一：取精液标本，离心，取上清液于离心管中，得到精浆标本，向所述精浆标本中加入试剂1及试剂2，混匀，测定吸光度值A_测定1，其中，所述试剂1为包括还原型谷胱甘肽、EDTA-Na₂以及叠氮钠的磷酸盐缓冲液，所述试剂2为包括谷胱甘肽还原酶以及NADPH的磷酸盐缓冲液；

步骤二：向上述混合反应液中加入试剂3，混匀，反应，测定吸光度值A_测定2，其中所述试剂3为包括异丙苯过氧化氢的磷酸盐缓冲液；