[发明专利]一种敲除杆状杆粒病毒必需基因的方法

说明书

本发明公开了一种敲除杆状病毒必需基因的方法，具体包括以下步骤将转移载体和改造的杆状病毒杆粒在家蚕细胞中进行同源重组和纯化，并抽提DNA，再转化大肠杆菌感受态，挑取菌落做菌液PCR，得到含有中间敲除株的菌株，然后将中间敲除株病毒与未经改造的杆粒病毒共感染家蚕细胞进行同源重组并抽提DNA，再转化大肠杆菌感受态，挑取蓝色菌落做菌液PCR，得到含有必需基因敲除的杆粒的菌株，实现杆状病毒必需基因的敲除。本发明无需特定的细胞或者细菌系统，省时省力，可以节省资金投入，而且无需特殊设备，操作简单，易于上手，可以应用于其它杆状病毒必需基因的敲除，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于昆虫杆状病毒基因功能研究领域，具体涉及一种敲除杆状病毒必需基因的方法，可以节省劳动力，提高工作效率。

背景技术

杆状病毒是一类囊膜包被的双链环状DNA病毒,基因组大小一般为80-180 kb，编码基因100-200个。根据功能的重要性，可以分为必需基因和非必需基因。杆状病毒用途广泛，可用于外源基因过量表达、生物杀虫剂、杆状病毒表面展示和基因治疗载体。家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus, BmNPV)是家蚕的天然病原微生物,是杆状病毒的代表。该病毒引起的血液型脓病有爆发规模大，影响时间长等特点，每年因该病引起蚕茧损失约占总蚕病损失的60%以上, 但尚无特效药，主要以预防为主。研究杆状病毒的必需基因能解析病毒的复制和装配机制，为抗杆状病毒提供理论参考。

研究必需基因的功能，首先就要获得必需基因敲除后的敲除株。由于敲除必需基因后，杆状病毒无法复制、装配或者运输，不能在体外培养的细胞之间传播扩散，因此，在未改造的BmN细胞中进行同源重组无法获得纯化的敲除株。传统的方法是通过转座将待敲除的必需基因整合到BmN细胞的基因组上，然后使用该转基因细胞系进行同源重组敲除必需基因，并使用低熔点琼脂糖进行多轮纯化。这一方法的缺点是，获得转基因细胞系耗时耗力，而且细胞容易污染。此外，纯化过程对于技术要求较高而且周期长，还需要使用价格高昂的低熔点琼脂糖。还有一种基于RED重组技术在大肠杆菌中敲除必需基因的方法，这种方法无需构建转移载体，重组的同源臂直接设计在引物上，然后使用线性PCR产物直接转化BW25113大肠杆菌，然而，由于线性DNA转化效率低而且RED技术重组率低，必需使用到电击仪和抗生素筛选。此外，由于PCR引物很长，成本高而且扩增条件需要摸索，耗时耗力。编码RED重组酶的PKD46质粒使用温度敏感型复制子，需要在30°C培养，并需要在42°C高温处理使PKD46质粒丢失，而RED重组酶需用L-阿拉伯糖诱导表达。因此，基于RED技术的敲除方法虽然无需构建转移载体，但其对于技术和设备要求高，不容易实现。

基于上述实际情况，研究上迫切需要开发一种既能高效敲除杆状病毒必需基因，无需特殊设备，又容易操作的新方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种敲除杆状杆粒病毒必需基因的方法，实现高效获得必需基因敲除的纯化病毒，提高工作效率。

为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：

一种敲除杆状病毒必需基因的方法，包括以下步骤：

（1）转移载体的构建和杆状病毒杆粒的改造；

（2）转移载体和改造的杆状病毒杆粒在家蚕细胞中进行同源重组和纯化，并抽提DNA；

（3）将抽提的DNA转化大肠杆菌感受态，挑取菌落做菌液PCR，得到含有中间敲除株的菌株；

（4）将中间敲除株病毒与未经改造的杆粒病毒共感染家蚕细胞进行同源重组并抽提DNA；

（5）将抽提的DNA转化大肠杆菌感受态，挑取蓝色菌落做菌液PCR，得到含有必需基因敲除的杆粒的菌株，实现杆状病毒必需基因的敲除。