[发明专利]一种敲除杆状杆粒病毒必需基因的方法

权利要求书

1.一种敲除杆状病毒必需基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）转移载体的构建和杆状病毒杆粒的改造；以载体为模板，进行反向PCR将载体线性化，得到线性载体；以杆状病毒杆粒DNA为模板，PCR扩增必需基因及其上下游序列，得到待敲除必需基因序列及其上下游序列的扩增产物；以中间转移载体为模板，进行反向PCR，得到中间转移载体线性扩增产物；以报告基因质粒为模板，PCR扩增报告基因及其多角体启动子，得到报告基因扩增产物；通过酶切连接将待敲除必需基因序列及其上下游序列的扩增产物连接到线性载体上，构建中间转移载体，再将报告基因扩增产物通过酶切连接到中间转移载体线性扩增产物上，构建所述转移载体；以杆状病毒杆粒为模板，PCR扩增必须基因，得到必需基因扩增产物；再将必需基因扩增产物连接到载体上，从而构建必需基因质粒；再将必需基因通过Bac-to-Bac转座系统转座到杆状病毒杆粒的多角体基因座位，得到改造的杆状病毒杆粒；

（2）转移载体和改造的杆状病毒杆粒在家蚕细胞中进行同源重组和纯化，并抽提DNA；将转移载体和改造的杆状病毒杆粒DNA共转染家蚕细胞中进行同源重组；然后取上清与家蚕细胞在96孔板中孵育；然后将发绿色荧光细胞数最多的孔中的上清取出添加到另外一个96孔板中孵育；然后将发绿色荧光细胞数最多的孔中的上清加入到铺满家蚕细胞的培养瓶中，培养后抽提DNA；

（3）将抽提的DNA转化大肠杆菌感受态，挑取菌落做菌液PCR，得到含有中间敲除株的菌株；

（4）将中间敲除株病毒与未经改造的杆粒病毒共感染家蚕细胞进行同源重组并抽提DNA；

（5）将抽提的DNA转化大肠杆菌感受态，挑取蓝色菌落做菌液PCR，得到含有必需基因敲除的杆粒的菌株，实现杆状病毒必需基因的敲除；

所述必需基因为orf92基因；家蚕细胞为家蚕卵巢细胞系；杆状病毒为家蚕核型多角体杆状病毒。

2.根据权利要求1所述敲除杆状病毒必需基因的方法，其特征在于：步骤(3)中，将抽提的DNA转化大肠杆菌感受态，然后涂布于琼脂培养平板上，培养后，挑取菌落进行菌液PCR，得到含有中间敲除株的菌株。

3.根据权利要求1所述敲除杆状病毒必需基因的方法，其特征在于：步骤(4)中，从含有中间敲除株的菌株中抽提杆状病毒杆粒DNA并转染家蚕细胞，然后取上清与未经改造的杆粒病毒共感染家蚕细胞，培养3天，再抽提DNA。

4.根据权利要求1所述敲除杆状病毒必需基因的方法，其特征在于：步骤(5)中，将抽提的DNA转化大肠杆菌感受态，然后涂布于琼脂培养平板上，培养后，挑取蓝色菌落做菌液PCR，得到含有杆状病毒必需基因敲除的杆粒的菌株。

5.根据权利要求1所述敲除杆状病毒必需基因的方法得到的含有杆状病毒必需基因敲除的杆粒的菌株。