[发明专利]一种制备重组粘质沙雷氏菌核酸酶的方法

说明书

本发明提供了一种制备重组粘质沙雷氏菌核酸酶的方法，包括：将粘质沙雷氏菌核酸酶的编码核酸与突变型SUMO3标签的编码核酸进行融合表达，分离获得粘质沙雷氏菌核酸酶。本发明通过优化原核表达提高了蛋白的产量；通过SUMO3的突变改造，提高了重组粘质沙雷氏菌核酸酶的复性率和均一性。同时，本发明也简化了纯化步骤，降低了生产成本，适合重组粘质沙雷氏菌核酸酶的大规模工业生产。

技术领域

本发明属于生物医药领域；更具体地，涉及一种制备重组粘质沙雷氏菌核酸酶的方法。

背景技术

核酸酶是可以切割核酸核苷酸亚单位之间磷酸二酯键的酶。在遗传机制的很多方面发挥着重要作用，包括参与避免突变(DNA修复、复制和重组)、清除生长和代谢过程中产生的多余核苷酸和磷酸盐、防御外来的核酸分子、细胞程序性死亡和感染；在食品工业中核酸酶可用于生产核酸增味剂，如单磷酸鸟苷、单磷酸肌苷等；在医药工业中核酸酶用于生产其它核苷酸、疫苗和基因治疗产品。

核酸酶按底物特异性可分为两类：糖类特异性核酸酶(脱氧核糖核酸酶或核糖核酸酶)和降解DNA、RNA的糖类非特异性核酸酶。在所有非特异性核酸酶中，来源于粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的核酸内切酶能水解各种形式的DNA和RNA(单链、双链、线性和环形)，生成5’-磷酸单核苷酸和5’-磷酸寡核苷酸终产物，对核酸的序列没有严格要求，没有蛋白酶活性。该核酸内切酶的应用较多，可以有效去除重组蛋白中的核酸污染；去除病毒疫苗和基因治疗病毒载体生产中的核酸污染，使其符合FDA指南中核酸含量的要求；可以用于实时定量PCR测定重组病毒滴度；降低由核酸导致细菌或细胞裂解液的高粘度使其易于过滤，有保护蛋白纯化柱的功效；防止细胞成团；提高包涵体蛋白复性率；在二维凝胶电泳中提高蛋白质分离效率和双向电泳的分辨率等。

来源于粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的核酸酶由266个氨基酸组成，与其它革兰氏阴性菌不同，1-21氨基酸组成的信号肽帮助核酸酶分泌到培养基中，其它革兰氏阴性菌的蛋白质被分泌到质膜空间而不是周围的培养基，在分泌过程中信号肽(1-21氨基酸)被切除；具有水解核酸酶活性的22-266氨基酸部分被分泌到培养基中，分子量约为26.7kDa。研究发现在粘质沙雷氏菌中将核酸酶分泌到培养基中信号肽(1-21氨基酸)是必须存在的，但是在大肠杆菌中表达重组粘质沙雷氏菌核酸酶即使没有信号肽(1-21氨基酸)，重组粘质沙雷氏菌核酸酶也可以被分泌到培养基中。

现有的方法中，虽然重组粘质沙雷氏菌核酸酶在大肠杆菌中分泌表达，但是依旧约有50％的重组粘质沙雷氏菌核酸酶无法被分泌到培养基中(详见发明专利US5173418A)，使其产量严重受限，且留在胞内的重组粘质沙雷氏菌核酸酶具有水解大肠杆菌基因组的能力，损伤大肠杆菌基因组，进一步限制了重组粘质沙雷氏菌核酸酶的产量，因此重组粘质沙雷氏菌核酸酶的产量较低，即使采用高密度细菌发酵的方法，也仍需处理几十至几百升的培养基上清，增加重组粘质沙雷氏菌核酸酶的生产时间和成本。此外，例如US5173418A的方案，其构建质粒不带有纯化标签，无法采用快速、高效的亲和层析纯化方法，只能采用硫酸铵沉淀、离子交换层析和排阻层析等多步骤纯化方法，致使纯化步骤繁琐、生产耗时长。现有的其他一些表达方法中，虽然通过在重组蛋白的N端和C端引入标签提高纯化效率，但是无法完全切除标签，重组生产获得的粘质沙雷氏菌核酸酶与天然沙雷氏菌的核酸酶氨基酸序列存在差异。

综上所述，现有制备重组粘质沙雷氏菌核酸酶发明专利存在蛋白产量低、蛋白不均一、纯化步骤繁琐、生产耗时长和生产成本高等问题亟待解决。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备重组粘质沙雷氏菌核酸酶的方法。

在本发明的第一方面，提供一种制备重组粘质沙雷氏菌核酸酶的方法，包括：将粘质沙雷氏菌核酸酶的编码核酸与突变型SUMO3标签的编码核酸进行融合表达，分离获得粘质沙雷氏菌核酸酶；其中，所述突变型SUMO3标签，其第47位由Cys突变为Ser。