[发明专利]基于RPA-LbCas12a-TTECDS体系的沙门氏菌检测引物组、方法与试剂盒

权利要求书

1.基于RPA-LbCas12a-TTECDS体系的沙门氏菌检测引物组，包括crRNA和RPA引物对，其特征在于，所述RPA引物对包括：根据针对invA基因的crRNA3分子的核苷酸序列设计的RPA引物对，所述crRNA3分子的核苷酸序列如SEQ NO.19所示；以及根据针对fimY基因的crRNA10分子的核苷酸序列设计的RPA引物对，所述crRNA10分子的核苷酸序列如SEQ NO.26所示。

2.根据权利要求1所述的基于RPA-LbCas12a-TTECDS体系的沙门氏菌检测引物组，其特征在于，所述根据crRNA3分子的核苷酸序列设计的RPA引物对包括：上游引物的核苷酸序列如SEQ NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ NO.4所示。

3.根据权利要求1所述的基于RPA-LbCas12a-TTECDS体系的沙门氏菌检测引物组，其特征在于，所述根据crRNA10分子的核苷酸序列设计的RPA引物对包括：上游引物的核苷酸序列如SEQ NO.6所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ NO.8所示。

4.根据权利要求1所述的基于RPA-LbCas12a-TTECDS体系的沙门氏菌检测引物组，其特征在于，所述crRNA包括：针对invA基因的crRNA3分子改进的crRNA3+3'DNA7，其核苷酸序列如SEQ NO.29所示；以及针对fimY基因的crRNA10分子改进的crRNA10+3'DNA7，其核苷酸序列如SEQ NO.30所示。

5.基于RPA-LbCas12a-TTECDS体系的沙门氏菌检测方法，其特征在于，该方法用于非诊断或治疗目的，包括如下步骤：向含有沙门氏菌靶标核酸分子的体系中加入权利要求1-4任意一项所述的引物组、RPA冻干粉、醋酸镁、Rehydration Buffer、无菌水进行RPA扩增反应，然后取RPA反应产物、加入权利要求4所述的crRNA、LbCas12a、ssDNA-FQ报告基因分子、10×NEBuffer 2.1、无菌水进行反应，再将反应产物进行荧光检测。

6.根据权利要求5所述的基于RPA-LbCas12a-TTECDS体系的沙门氏菌检测方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：

(1)以沙门氏菌的invA基因和fimY基因为靶标核酸分子，分别设计靶点特异性的crRNA核苷酸序列，再构建crRNA体外转录载体并进行体外转录和纯化，或者直接合成，得到crRNA分子，针对crRNA分子的核苷酸序列设计RPA引物对；

(2)将步骤(1)所得引物对、RPA冻干粉、醋酸镁、Rehydration Buffer加入到含有沙门氏菌靶标核酸分子的体系构成扩增系统进行RPA扩增反应，得到RPA扩增产物；

(3)将7mer DNA延伸至步骤(1)得到的crRNA分子的核苷酸序列的3’末端，得到最终的crRNA，将crRNA、RPA扩增产物、LbCas12a、10×NEBuffer 2.1(缓冲液)、ssDNA-FQ报告基因分子构成系统进行反应，产物通过荧光检测获得检测结果。

7.根据权利要求6所述的基于RPA-LbCas12a-TTECDS体系的沙门氏菌检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述扩增系统具体为50μL RPA扩增反应系统，包括：一管RPA冻干粉，29.5μL Rehydration Buffer(RPA缓冲液)，2.4μL的正向引物和反向引物，适量的基因组DNA,2.5μL的醋酸镁，以适量的无菌水至50μL。

8.根据权利要求6所述的基于RPA-LbCas12a-TTECDS体系的沙门氏菌检测方法，其特征在于，步骤(3)中所述ssDNA-FQ报告基因分子具体为FAM-TTTTTT-BHQ1。