[发明专利]一种用于短链非编码RNA检测的模块化酶电路检测系统

说明书

本发明涉及生物技术领域，公开了一种用于短链非编码RNA检测的模块化酶电路检测系统，包括识别模块、扩增模块和信号输出模块。本发明将酶作为反应体系的核心，把具有不同功能的酶进行组合使其能够成为具有特定功能的内聚化酶基模块，简化了核酸序列以及结构设计，针对不同靶物对象，仅需要对结构核酸序列进行设计，即可实现检测，降低了干扰，并实现了更加高效的检测，实现对极低浓度的ncRNA的高特异性高灵敏度检测。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于短链非编码RNA检测的模块化酶电路检测系统。

背景技术

短链非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)能在细胞间信号传导中发挥重要作用并影响受体细胞蛋白表达，但由于其在早期筛查中含量低而不易检测，因此将微弱的ncRNA样品信息(拷贝数或浓度)转换成为可以被充分且准确识别的信息(光学或电学信号)是实现对其有效检测的关键点。酶参与的等温扩增技术，可将待测靶物进行指数级的扩增，实现超灵敏的检测。发明人发现以熵驱动的链置换反应对病毒RNA进行检测，需要借助单分子荧光显微镜等大型设备才能达到现有技术中的检测效果，由此可见酶参与的核酸扩增技术可以实现媲美大型仪器的超灵敏检测，更有利于床边检测技术(POCT)的发展。在常规的酶参与等温扩增技术中，酶通常是配合复杂的核酸设计以实现靶标检测，这类检测方法一般是将核酸作为控制发生的“核心机构”，以熵驱动的链置换反应作为启动下一步反应的控制器，通过调控核酸序列、二级结构以及空间排布从而实现对目标靶物的分析检测，其主要的技术瓶颈在于：①由于核酸序列环环相扣，各步反应间的耦合程度极高，这会导致整体反应体系尤为复杂且易被污染；②在针对多重检测靶物时，对碱基互补以及核酸结构的过度依赖会导致设计难度成倍增加。

现有的基于DNA分子电路的等温扩增技术通常依靠核酸序列的反复利用，甚至是参与多个循环步骤，从而提高灵敏度。在这一类的设计中，由于核酸同时参与多步反应，致使整个检测体系耦合程度极高，任何一个环节中的核酸产生不正确的杂交或者扩增，都会导致整个检测系统的崩溃，如果对不正确的核酸序列进行调整，又将相应的修改整个反应体系。

因此，发明人从另一个角度出发，将酶作为反应体系的核心，把具有不同功能的酶进行组合使其能够成为具有特定功能的内聚化酶基模块，发明了一种用于短链非编码RNA检测的模块化酶电路检测系统。

发明内容

基于以上问题，本发明提供一种用于短链非编码RNA检测的模块化酶电路检测系统，本发明将酶作为反应体系的核心，把具有不同功能的酶进行组合使其能够成为具有特定功能的内聚化酶基模块，简化了核酸序列以及结构设计，降低了干扰，并实现了更加高效的检测。

为解决以上技术问题，本发明提供了一种用于短链非编码RNA检测的模块化酶电路检测系统，包括识别模块、扩增模块和信号输出模块；

识别模块包括II反转录酶、Nt.AlwI酶和SL-MB引物，SL-MB引物的核苷酸序列见SEQ ID No.1，II反转录酶将与SL-MB引物结合的待测靶物短链非编码RNA逆转录为cDNA，Nt.AlwI酶通过识别切刻位点5’-GGATCNNNN-3’将完成逆转录后的cDNA剪切，从而得到第一段接口核酸initiator；

扩增模块包括DNA聚合酶、Nt.AlwI酶和sub1引物，sub1引物的核苷酸序列见SEQ ID No.2，sub1引物与第一段接口核酸initiator杂交结合，之后DNA聚合酶沿sub1引物对initiator序列进行聚合，得扩增序列，Nt.AlwI酶通过识别切刻位点5’-GGATCNNNN-3’剪切扩增序列，得到与initiator序列一致的第二段接口核酸initiator*，由于initiator*与initiator序列一致，因此initiator*可以再次与sub1引物杂交结合，从而实现指数扩增；