[发明专利]改变细胞内基因组序列的方法、基因编辑细胞及应用

说明书

本发明提供了一种改变细胞内基因组序列的方法、基因编辑细胞及应用，将短的DNA片段插入特定DNA区域，改变靶标DNA序列，此方法可以被应用于基因修复和基因治疗。例如，用于造血干细胞HBB基因修复，利用基因编辑技术靶向修复β‑地中海贫血41/42(‑TCTT)型突变，通过设计并合成能识别引导核酸酶至目标基因靶序列的sgRNA，将其与核酸酶混合引入β‑地贫密码子41/42(‑TCTT)造血干细胞中，同时引入缺失的41/42(‑TCTT)双链片段高效修复该突变位点的移码突变，恢复蛋白基因的正常表达。本发明修复效率高，修复后的患者造血干细胞在自体移植后可以重建患者血液系统并治疗地中海贫血疾病。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种改变细胞内基因组序列的方法、基因编辑细胞及应用。

背景技术

近年细菌和古细菌中一种用来抵御噬菌体和质粒等外源DNA片段入侵的获得性免疫机制得到了阐释。该系统由Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats(CRISPR)和CRISPR-associated(CAS)基因组成。CRISPR系统的免疫干扰过程主要包括3个阶段：适应、表达和干扰。适应阶段，CRISPR系统会将来自噬菌体或质粒的DNA短片段整合到前导序列和第一段重复序列之间，每一次整合都伴随着重复序列的复制，进而形成一个新的重复-间隔序列单元。表达阶段，CRISPR基因座会被转录成一段CRISPR RNA(crRNA)前体(pre-crRNA)，该前体在Cas蛋白和反式编码小RNA(trans-encoded smallRNA，tracrRNA)的存在下会在重复序列处被进一步加工成小的crRNA。成熟的crRNA与Cas蛋白形成Cas/crRNA复合体。干扰阶段，crRNA通过其与靶序列互补的区域引导Cas/crRNA复合体寻找靶点，并在靶点位置通过Cas蛋白的核酸酶活性造成靶点位置的双链DNA断裂，从而使靶标DNA失去原有功能。其中与靶点3′端紧邻的3个碱基必须是5′-NGG-3′的形式，从而构成Cas/crRNA复合体识别靶点所需的PAM(protospacer adjacent motif)结构。

CRISPR系统分为I，II，III型三个家族，其中II型系统仅需要Cas9蛋白即可在tracrRNA的协助下将pre-crRNA加工成与tracrRNA结合的成熟crRNA。人们发现通过人工构建模拟crRNA：tracrRNA复合体的单链嵌合体引导RNA(guide RNA，又称sgRNA)，即可有效的介导Cas9蛋白对靶点的识别和切割，从而为在目标物种中利用CRISPR系统对目标DNA进行修饰提供了广阔的前景。

β-地中海贫血是一种常见的由于β-珠蛋白基因(HBB基因)缺陷导致成人血红蛋白异常的遗传性疾病，我国“地贫”基因携带者约3000万人，涉及近3000万家庭、1亿人口，重型和中间型“地贫”患者约30万人。其中，密码子(Codon)41/42(-TCTT)基因型是我国“地贫”中最为多见的一种，发病机制为HBB基因密码子41/42(-TCTT)移码突变造成氨基酸编码异常并形成终止密码子导致蛋白翻译的提前终止，使得HBB基因的功能丧失。目前，中间型和重型患者需要长期输血和去铁治疗来维持生命，唯一根治方式为异体造血干胞移细植术，但主要实施障碍是我国血液资源的紧缺、异体造血干细胞配型困难及移植相关并发症等。其中，利用慢病毒载体进行基因治疗，表现出极大的潜力，但是半随机的载体整合方式，具致癌风险。同时慢病毒中的表达元件在造血干细胞长期归巢和自我更新的过程中会逐渐沉默，使得疗效下降，极有可能无法达到终身治愈的目的。另外，临床所需的高浓度、高质量的慢病毒对设备和技术的要求极高，成本很难降低。因此，并行的、更加安全、成本更低的临床方案是非常有必要的。