[发明专利]改变细胞内基因组序列的方法、基因编辑细胞及应用

权利要求书

1.一种改变细胞内基因组序列的方法，其特征在于：

将短的DNA片段插入特定DNA区域，改变靶标DNA序列。

2.根据权利要求1所述的改变细胞内基因组序列的方法，其特征在于：

所述短的DNA片段包括2-15个碱基。

3.根据权利要求1所述的改变细胞内基因组序列的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，设计并制备能够识别并引导核酸酶至缺陷细胞的向导RNA，所述向导RNA为能够引导核酸酶在所述缺陷细胞DNA异常突变位点上游切割所述缺陷细胞DNA的向导RNA；

步骤2，采用基因编辑技术靶向所述缺陷细胞DNA异常突变位点造成双链断裂，同时提供短的DNA片段：向所述缺陷细胞中引入所述向导RNA、所述向导RNA能够识别并引导的核酸酶和所述短的DNA片段，所述向导RNA引导所述核酸酶在所述缺陷细胞DNA异常突变位点上游切割所述缺陷细胞DNA，并插入所述短的DNA片段进行非同源末端连接修复。

4.根据权利要求3所述的改变细胞内基因组序列的方法，其特征在于：

所述缺陷细胞为G0期原代细胞。

5.根据权利要求4所述的改变细胞内基因组序列的方法，其特征在于：

所述缺陷细胞为造血干细胞HBB基因的G0期原代细胞。

6.根据权利要求5所述的改变细胞内基因组序列的方法，其特征在于：

所述向导RNA为能够引导核酸酶在密码子41/42(-TCTT)位点上游1个碱基处切割所述造血干细胞DNA的向导RNA。

7.根据权利要求6所述的改变细胞内基因组序列的方法，其特征在于：

所述向导RNA的靶向序列为以下序列中的任意一种或多种：

TCCCCAAAGGACTCAACCTC；

CCCCAAAGGACTCAACCTCT；

GGACTCAACCTCTGGGTCCA；

GACTCAACCTCTGGGTCCAA；

GACCCAGAGGTTGAGTCCTT；

ACCCAGAGGTTGAGTCCTTT；

CCCAGAGGTTGAGTCCTTTG。

8.根据权利要求3-7任一权利要求所述的改变细胞内基因组序列的方法，其特征在于：

所述向导RNA为碱基经过化学修饰的RNA。

9.根据权利要求4所述的改变细胞内基因组序列的方法，其特征在于：

所述短的DNA片段为包括正常的HBB基因缺失的密码子41/42(-TCTT)对应序列的双链片段，且所述短的DNA片段为两条互补的单链短片段oligo退火后产物。

10.根据权利要求9所述的改变细胞内基因组序列的方法，其特征在于：

所述短的DNA片段的序列为TTCT和AGAA。

11.根据权利要求3所述的改变细胞内基因组序列的方法，其特征在于：

将所述核酸酶、所述向导RNA或所述短的DNA片段引入造血干细胞的方式包括：载体转化、转染、热休克、电穿孔、转导、基因枪、显微注射、病毒、纳米颗粒介导的导入。

12.根据权利要求11所述的改变细胞内基因组序列的方法，其特征在于：

将所述核酸酶、所述向导RNA或所述缺失的双链供体采用电穿孔的方式引入造血干细胞：

将所述核酸酶和所述向导RNA形成第一复合物，再将所述第一复合物通过电穿孔的方式引入到造血干细胞中，将所述缺失的双链供体通过电穿孔的方式引入到造血干细胞中；或者

将所述核酸酶、所述向导RNA和所述缺失的双链供体形成第二复合物，再将所述第二复合物通过电穿孔的方式引入到造血干细胞中。